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牛结核胶体金免疫层析诊断方法的建立和初步应用

冯向辉  
【摘要】: 牛结核病(Bovine tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M. bovis)引起的一种人畜共患传染病。该病的流行与传播不仅阻碍着畜牧业的可持续发展,而且严重的威胁到食品和公共卫生安全。目前,控制牛结核的唯一方法是通过“检疫—扑杀”措施淘汰阳性牛,因此,准确而及时的诊断方法对该病的控制极为重要,牛型结核菌素皮内变态反应(Tuberculin skin test TST )是国际卫生组织唯一推荐的检测方法,但该方法存在非特异性反应和因细胞免疫水平下降引起的假阴性反应等不足,使得结核菌素皮内变态反应的准确性受到质疑。因此,研制简便、快速、敏感性高、特异性强的牛结核病的诊断方法对牛结核病的控制有着重要意义。 利用DNAstar对牛结核分支杆菌的三个主要抗原mpb70、mpb83、esat-6的基因序列进行预测分析,将预测的抗原指数高的抗原表位基因序列经全基因合成后,将其连接到表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET28a-mpb-70-83-esat-6,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定,结果检测到蛋白分子量约为21ku的重组蛋白。经NI-NTA纯化重组蛋白后经Western blot鉴定,结果显示该重组蛋白可被牛结核分支杆菌的多克隆抗体识别,表明其具有很好的反应原性。 根据胶体金免疫层析技术原理,用健康牛血清IgG和大肠杆菌表达的牛结核分枝杆菌MPB70-83-ESAT-6蛋白分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获杭原,制备牛结核抗体检测试纸条,并对其最佳工作条件进行确定。结果:样品垫和金标垫的最佳处理液分别为PH8.0的含3%BSA、0.1%Tween-20的Tris缓冲液和PH8.0的含3%BSA、6%蔗糖、0.1%Tween-20的Tris处理液;MPB70-83-ESAT-6抗原的最适包被浓度为2.5mg/mL;研制的试纸条不与牛副结核病、牛巴贝斯病、口蹄疫和牛传染性鼻气管炎病阳性血清反应,具有较高的特异性;该试纸条的最低检出稀释度为1:640;用制备的试纸条检测临床样本血清并与TST进行比较,试纸条与TST的符合率为80%。将制备的试纸条置室温密封保存,分别在保存1、3、5个月后用试纸条检测牛结核阳性血清和阴性血清,试纸条在室温保存1、3、5个月后其对阴阳性血清的检测结果与保存前均相同。该试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为牛型结核菌素皮内变态反应(TST)的辅助诊断方法,具有良好的应用前景。


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