棉铃虫中肠靶标蛋白的分离与鉴定

【摘要】： 棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)是鳞翅目夜蛾科的一种世界性害虫。该虫食性杂,为害包括棉花、小麦、玉米、高粱、番茄、豆类、瓜类等在内的20多科200余种植物。昆虫围食膜是保护其中肠的一道物理屏障,破坏围食膜就可能使其中肠处于不正常的生理状态而最终导致昆虫死亡。本研究通过提取棉铃虫围食膜蛋白,成功制备了棉铃虫围食膜总蛋白多克隆抗血清,并以此免疫筛选棉铃虫中肠cDNA表达文库。共进行了十一次筛选,得到385个不同阳性克隆,挑选其中插入片段较大的26个克隆进行测序,并对其中三个蛋白进行了分离鉴定。 HM72基因(GenBank登录号为HM017910)编码棉铃虫围食膜粘蛋白,该cDNA全长2 888bp,开放阅读框长为2 448bp。推导的蛋白序列表明,HM72蛋白前体由816个氨基酸组成,N-端带有22个氨基酸的信号肽,预期分子量为82.6kDa。DNAMAN分析其富含甘氨酸、苏氨酸和天冬氨酸,等电点为3.69,为酸性蛋白质。结构域分析表明具有5个几丁质蛋白结合功能域,一个粘蛋白结构域和两个甘氨酸-天冬氨酸富集区。构建BL21/pET21b-HM72、BL21/pET28b-HM72原核表达载体,并成功表达。Western blot分析表明对HM72在蜕皮、粪便、围食膜、中肠中存在,并且整个中肠均分泌HM72。而在脂肪体、体壁、马氏管、唾腺、消化液、血淋巴中没有检测到HM72的存在。从HM72序列第760位和1281位设计一对引物,转录合成dsRNA,并注射至棉铃虫幼虫体内,试图沉默HM72,但未观察到明显变化。 HC3基因(GenBank登录号为GU119888)编码棉铃虫羧酸酯酶,该cDNA全长2896bp,共编码795个氨基酸。软件分析表明,HC3的等电点pI为3.94,该蛋白活性中心包括3个氨基酸残基(催化三联体):Ser204, Glu331, His444;第545-773位包含大量高度重复的Gly,Asp、Glu构成亲水区。将该基因克隆至原核表达载体pET-21b,转化到大肠杆菌BL21中,经0.6mM IPTG诱导,成功表达约100kDa HC3蛋白。以α-醋酸萘酯溶液为底物,检测表达的羧酸酯酶活性为0.32mmol/100μL酶液。 HA8基因(GenBank登录号为HM012573)编码棉铃虫Argonaute蛋白,该cDNA全长为2 353bp,其N端缺失一部分序列,只带有3个氨基酸的信号肽,无起始密码子。经结构域分析发现其包含完整PAZ结构域和PIWI结构域,具备Argonaute蛋白的特征。构建BL21/pET21b-HM72、BL21/pET28b-HM72原核表达载体,并成功表达。正在采用RACE技术以获得HA8全长cDNA。