河北省苹果潜隐性病毒的分布特征

【摘要】： 苹果病毒病在世界各苹果主产区分布广泛,影响严重,具有危害性强、传播扩散快和难以治愈等特点。苹果病毒破坏和干扰树体的正常生理功能,导致树势减弱,产量降低,品质下降,造成经济上的巨大损失,所以,苹果的无病毒化栽培任务迫在眉睫,而准确掌握目前苹果病毒病的分布情况是此项工作的基础和理论依据。因此,研究中以河北省苹果主要产区果园的苹果树为试材,以RT-PCR技术为检测手段,对河北省苹果主产区病毒类病害的侵染状况做全面调查,并对检测方法做进一步改进和优化。主要结果如下: 1.苹果潜隐性病毒在河北省主产区的分布特征:(1)通过对河北省苹果主产区7个市,29个果园采样分析中,结果表明:采样果园均不同程度地受到苹果潜隐性病毒的侵染,果园病毒侵染率100%。(2)三种苹果潜隐性病毒(ASGV、ASPV、ACLSV)在所有供参试样品中的整体发生率分别为:91.63%、88.48%、81.45%;总体混合侵染率为68.04%。相对而言,ASGV的侵染率最高,ACLSV的侵染率最低。(3)苹果潜隐性病毒在不同树龄的树体之间的侵染率有差异性,数据分析结果显示,新建果园,三种潜隐性病毒的侵染率均有上升趋势。1-3年生幼树的带病毒率要普遍高于其他树龄的结果大树。(4)三种苹果潜隐性病毒在不同品种间的侵染也有一定差异,比较而言,富士、红星、金冠、王林的病毒侵染率普遍高于国光、嘎拉、乔纳金三个品种。其中,金冠和富士的病毒侵染率最高,三种病毒侵染率均高于90%;国光的病毒侵染率相对最低,三种病毒的侵染率在70%-85%之间。(5)在地区分布上,三种苹果潜隐性病毒侵染率由南向北呈逐渐增加趋势,但有局部特殊性。其中,张家口地区的苹果潜隐性病毒侵染率普遍高于其他地区,三种病毒的侵染率均在90%以上,个别果园高达100%,病毒混合侵染率84.96%;衡水地区的苹果潜隐性病毒侵染率相对最低,三种苹果潜隐性病毒的侵染率在80%-90%之间,混合侵染率为64.68%。 2.田间苹果潜隐性病毒检测体系的改进和优化:(1)田间成熟组织RNA提取技术优化:针对田间苹果成熟组织富含多糖、多酚和大量次生代谢产物的特点,从四个方面改进了苹果组织常规RNA提取技术:提取RNA用的试验器皿仅高压灭菌和高温烘烤,不使用氯仿浸泡或DEPC处理,用ddH2O代替DEPC处理水;提取过程均在常温下进行,普通高速离心机代替冷冻高速离心机;调整提取液和植物材料比例,将植物材料用量降低为常规方法的1/20;低浓度乙醇结合高浓度Na+(K+)离子条件下,用苯酚/氯仿抽提法去除多糖,有效保护了提取的总RNA质量。(2)RT-PCR技术对田间苹果潜隐性病毒批量检测体系的探索:使用统一体系分别对三种苹果潜隐性病毒做逆转录反应;采用RT-PCR技术初步探索其批量检测体系,RT-PCR试剂组成为:10×缓冲液、MgCl2(25mM)、dNTPs(2.5mM)、病毒上、下游引物、TaqDNA聚合酶、RNasin、PCRMarker、超纯水。依据不同试剂的不同比例分别配制成号、号、号试剂,在安全储存期(四个月)内,均可使用上述三种试剂分别对ASGV、ASPV、ACLSV进行快速检测。 3.样品采集及保存方案优化:田间采集带有生长点的茎尖和幼叶为试材,样品采集后直接放入泡沫保温容器中,加冰块保温在0℃低温环境储存和运输,期间不断更换已融化的冰块,保存和运输时间可达五天,且不影响样品RNA的提取。如果在无法满足条件的情况下,可采用常温储存,幼叶最长保存时间为3天。