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光学分子影像技术在肝癌动物模型构建及诊疗中的应用研究

李岗  
【摘要】:研究背景光学分子影像的概念首先由Weissleder于1999年提出(Weissleder R. Molecular imaging:exploring the next frontier[J]. Radiology,1999,212(3):609-14.),是指在分子水平上反映生物体生理、病理变化的特异性成像技术,能够提供以解剖结构为基础、以细胞水平为基准的疾病发生、发展的信息,故可作为疾病分期诊断的定位、定性、定量的可靠依据。相对于离体检测方法,其优势在于可对同一机体实现实时、无创、动态观察,同目前其它医学影像手段相比具有灵敏度高、易操作、无辐射、投入小等优点,由于其可以在细胞水平体现和鉴别活体内不同生理、病理过程,相对于之前的影像技术主要定位在形态和结构层面上认识疾病过程,分子影像技术着力于在生物化学和细胞内来揭示疾病的发生发展过程(Blow N. In vivo molecular imaging:the inside job[J]. Nature Methods,2009,6(6): 465-469.).随着计算机科学、分子生物学、生物工程学、临床医学等学科的不断进步和交叉给医学提供了大量精确量化的实验模型,大大促进了临床实践的发展,但仍有许多在体实验无法在真人身上进行,因此动物实验仍是研究疾病发病机理、临床表现等的重要方法,其可以较全面的了解相应的生理学和病理学信息,改善疾病尤其是恶性疾病的治疗方式,从而为开发新的诊疗技术提供有利保证。如前所述,小动物光学在体分子成像技术能在较短时间内提供生物组织内部细胞层面的高分辨率图像,并能跟踪病变组织的变化,进而从细胞水平和基因研究的角度获得疾病发生发展等生理学和病理学方面的详细资料,尤其是对恶性疾病如肿瘤等病变组织的活体成像研究,将大大推动人类对此类疾病的认识,有助于医疗工作者早日研究出治疗此类疾病的有效方法(Baker M. Whole-animal imaging:The whole picture[J]. Nature,2010,463(7283):977-980.)。本论文第一部分借助中国科学院自动化研究所分子影像重点实验室所拥有的IVIS200分子影像成像系统(Xenogen精诺真公司),在光学分子影像技术辅助下构建了裸鼠肝癌皮下及原位模型,实现了无创、实时、连续、直观地观测裸鼠活体内肝癌肿瘤的生物学行为,为后续研究肝癌的致病机理、药物疗效评估和手术治疗方法等方面搭建了良好的前期动物模型平台。肝脏肿瘤性疾病常用影像学方法来评价治疗效果,如通过观察一定时间内肿瘤体积大小改变来观察疗效,而临床对疾病的影像学诊断是以人体的病理形态改变为基础,其远远落后于在分子、细胞水平的病变。光学分子影像技术可在分子水平层面对病变进行检测,而不单单是疾病终末期的解剖形态改变,如化疗只需观察治疗药物的作用靶点变化情况,药物作用过程中一些关键的分子标记变化情况,即可推断这种治疗方法有无产生效用。所以,光学分子影像技术可较常规影像手段更早地发现病变,并对病变进行定性分析,使得临床医生可以在疾病的发生、形成阶段就对其进行有效的干预,达到早期观察治疗效果的目的(Zhang Q, Du Y, Xue Z, et al. Comprehensive Evaluation of the Anti-Angiogenic and Anti-Neoplastic Effects of Endostar on Liver Cancer through Optical Molecular Imaging. PLoS One,2014,9(1):8555-9.).近年来,芹黄素因其被证明具有抗炎、清除自由基和抗癌的潜力已被广泛应用于抗肿瘤的研究中,它是天然存在的一种黄酮类化合物,具有潜在的抗肿瘤活性。多项研究表明,芹黄素对于结肠癌、胃癌、肺癌、子宫肉瘤等均具有明显的抑制作用(Shukla S, Gupta S. Apigenin:a promising molecule for cancer prevention. Pharm Res,2010, 27(6):962-78.)。本论文第二部分我们利用已成功构建的裸鼠肝癌皮下及原位模型结合光学分子影像技术探讨和验证了芹黄素对肝癌的抑制作用,为发现新的肝癌治疗药物提供了有益的参考价值。小动物活体光学分子成像技术主要包括生物发光成像(Bioluminescence imaging, BLI)和荧光成像(Fluorescence imaging, FMI)两种方法,目前该技术主要用于观测药物代谢及靶向作用;基因的表达反应过程;标记示踪不同种类的干细胞;监测了解炎性反应过程;器官移植模型的监测;肿瘤原发、转移病灶的发现;抗肿瘤药物筛选;细菌病毒的繁殖生长及控制等。具体应用原理主要包括:(1)、利用荧光素本身在体内的特异性或非特异性分布,达到研究该荧光素在体内代谢过程的目的,本论文第三部分正是利用吲哚菁绿(indocyanine green, ICG)的荧光特性来监测其在肝脏代谢的过程;(2)、应用标记的荧光报告基团,研究被其标记的靶点在体内的分布和动态变化过程;(3)、使用不同种类的荧光素酶基因标记DNA或细胞,对基因靶点和表达所产生的生物反应过程予以监测,研究细胞及其以下水平的生物变化过程;(4)、应用与相关药物标记的荧光报告基团在体内的分布代谢情况,了解药物的疗效作用以及病变的转归等(Weissleder R, Pittet MJ. Imaging in the era of molecular oncology. Nature,2008, 452(7187):580-9.)。本论文第三部分将新型的在体分子荧光成像技术与经典的ICG肝脏功能检测实验相结合,研究了多药耐药相关蛋白2 (multidrug resistance associated protein2, MRP2)对ICG在肝脏代谢的作用,证明了MRP2是ICG在肝脏排泄的通道之一,对于光学分子成像技术应用于肝脏生理和病理机制的研究提供了初步引导作用,相信该技术在肝脏病理生理学研究中将成为一项新的研究手段。在医学临床实践中,外科医生在手术过程中通常依据肿瘤组织的色泽、形态、质地以及术前影像学资料等进行判断并切除,所以切除的范围与外科医生的临床经验密切相关。如果能有一种方法可以在术中帮助外科医生客观的判断出肿瘤的边界和数目,那么势必将大大提高手术肿瘤切除率、降低肿瘤术后复发率、减少再次手术,从而减少医疗费用、加快病人康复进程。2013年《自然医学》杂志提出,术中精确获取肿瘤边界信息将为临床手术提供重要的价值,与术中凭借医生主观视觉检查和触诊的方法相比,借助术中光学分子影像学的方法可以有效客观的评价肿瘤及其残存病灶组织,实现精确诊疗的目的(Nguyen QT, Tsien RY. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation--a new cutting edge. NatRev Cancer,2013,13(9):653-62.)。一般来说,术中影像学设备需要满足无辐射、高信背比的实时成像、操作方便简单等条件。目前,传统的临床诊断方法如CT、MRI、PET等设备因体积较大、操作复杂、成像时间长、不易搬动且有一定的辐射损害,均很难在术中实现有效的应用,所以需要进一步探索手术过程可以实时成像、操作方便、非侵入、无损害的成像设备。由中国科学院自动化研究所研制的光学分子影像手术导航系统(Surgical navigation system,SNS)基本满足了上述条件,相比目前其他的术中成像系统,SNS不仅具有操作简便的特性,确保较高信背比实时成像的同时,该系统还可以提供术中的实时解剖结构图像,这种高分辨率、高灵敏度和低噪声的图像为外科医生临床精确定位操作提供了重要保证。近年来,ICG由于具有产生近红外荧光的特点被发掘为乳腺癌前哨淋巴结活检的试剂,初步的研究结果显示皮内注射ICG通过荧光导向可以寻找到前哨淋巴结,与传统方法相比具有较高的检出率及较低的假阴性率(Chi C, Ye J, Ding H, et al. Use of Indocyanine Green for Detecting the Sentinel Lymph Node in Breast Cancer Patients:From Preclinical Evaluation to Clinical Validation. PLoS One,2013,8(12):8273-9.)。本论文第四部分也是利用ICG近红外荧光特性探索了其在SNS引导下应用于肝脏肿瘤精准切除的可行性,围绕肝癌的原位瘤和皮下瘤开展了前期动物实验和后期初步临床验证,实验结果证明了SNS能够快速准确定位肝脏肿瘤位置,给出客观的肿瘤边界信息。根据动物实验统计结果,通过光学分子影像手术导航方法切除肿瘤的裸鼠,生存时间明显长于常规肉眼手术切除方法的裸鼠,这也说明这种精确治疗可以有效的提高生存率,改善预后效果,为以后的临床广泛应用打下基础,希望在不久的将来,基于光学分子影像的手术导航方法可以在肿瘤精确定位切除中得到广泛应用。一、光学分子影像技术辅助下肝癌动物模型的建立目的:1.借助光学分子影像技术构建裸鼠皮下和原位移植性肝癌动物模型。2.为后续肝癌药物疗效评估和诊疗搭建前期动物模型平台。方法:1.HepG2-fLuc和HepG2-GFP标记的肝癌细胞裸鼠皮下肝癌模型的建立取20只4-6周雄性BALB/c裸鼠,分别抽取含1.0×107/mlHepG2-fLuc和HepG2-GFP细胞悬液接种于裸鼠腋部皮下,HepG2-fLuc细胞接种于左腋下,HepG2-GFP细胞接种于右腋下,各10只,建立裸鼠皮下移植性肝癌模型。2.HepG2-fLuc标记的肝癌细胞裸鼠原位肝癌模型的建立无菌条件下麻醉裸鼠,经右侧肋缘下1cm斜切口开腹显露肝脏,沿肝脏被膜下进针,缓慢推入含1.0×107/ml HepG2-fLuc细胞悬液,逐层关腹,同样方法建立10只原位模型。3.以上两种裸鼠肝癌模型在肿瘤细胞接种完成后,借助IVIS 200分子影像系统每日观察裸鼠的出瘤及远处转移情况并测量荧光强度、进行三维重建测量肿瘤体积等、绘制体积/荧光/时间增长曲线、统计成瘤率、记录荷瘤裸鼠生存时间。荷瘤裸鼠死亡后,剥离瘤块进行病理学检查。4.统计学处理对于连续变量采用均数±标准差(mean±SD)表示,对肿瘤体积和荧光强度随时间增长情况进行一般性统计描述,对于肿瘤体积大小和荧光强度变化双变量进行Pearson相关性分析,P0.05认为差异具有统计学意义。采用IBMSPSS19.0统计学软件进行数据分析,Prism5.0软件绘制图表。结果:1.二维定量分析结果使用工具栏中的感兴趣区域(region of interest,ROI)定量分析工具条对荧光信号进行圈选定量,定量数据出现在ROI上方,信号的强弱以图中的假色条表示,蓝色表示信号弱,红色表示信号强,假色条上均有数值标尺,下方显示定量单位及数值上下限。2.三维重建结果三维可视化模型分别从冠状面、矢状面和水平面再现了裸鼠各脏器结构,且可以任意角度旋转放大透明化,并可以显示肿瘤位置和定量测量肿瘤体积,便于观察。3.裸鼠成瘤情况皮下肿瘤模型组,20只裸鼠全部成瘤,成瘤率100%,均没有发现远处转移病灶;原位肿瘤模型组,在开腹肿瘤细胞种植过程中,3只裸鼠由于麻醉过度死亡(另追加3只裸鼠补齐),其中9只裸鼠全部成瘤,成瘤率90%,3只发现远处脏器转移病灶,4只出现腹腔转移病灶,肿瘤转移率70%,全部裸鼠瘤细胞接种后均未出现感染等并发症。4.生物荧光成像(Bioluminescence imaging, BLI)和自发荧光成像(Fluorescence imaging, FMI)增长情况为了监测皮下和原位HepG2-fluc-GFP肿瘤的进展,全部裸鼠在肿瘤细胞接种后12h即开始进行BLI和FMI图像数据采集。可以看出,无论皮下肿瘤还是原位肿瘤,体积和荧光强度均随着时间推移不断增长,一般来说,在接种后的前4天是肿瘤细胞适应体内环境的过程,在10天以后增长明显加快,定量的生物荧光强度和激发荧光强度分析结果也验证了这一结论。在肿瘤生长的前3周,荷瘤鼠体重随之逐渐生长,裸鼠活跃,肿瘤对其影响较小;随着肿瘤体积的增大,荷瘤鼠体重逐渐减少且活动不便,反映了肿瘤体积增大对裸鼠心、肝、肺等脏器的竞争抑制作用。5.肿瘤体积、生物荧光强度值和激发荧光强度值相关性分析(1) HepG2-fluc皮下肿瘤体积和荧光强度Pearson相关系数大小为0.998,说明HepG2-fluc皮下肿瘤体积和荧光强度为正相关,即体积越大,荧光强度值越高,对相关系数双侧检验的P=0.000,说明该相关系数具有统计学意义。(2) HepG2-GFP皮下肿瘤体积和荧光强度Pearson相关系数大小为0.998,说明HepG2-GFP皮下肿瘤体积和荧光强度为正相关,即体积越大,荧光强度值越高,对相关系数双侧检验的P=0.000,说明该相关系数具有统计学意义。(3) HepG2-fluc原位肿瘤体积增长和相应生物荧光强度的Pearson相关系数大小为0.954,说明HepG2-fluc原位肿瘤体积和荧光强度为正相关,即体积越大,荧光强度值越高,对相关系数双侧检验的P=0.000,说明该相关系数具有统计学意义。(4)个别肿瘤在生长到一定程度后,由于内部血供不足,呈现局部坏死病灶,结缔组织将瘤体分为多个小的肿瘤灶。肿瘤病灶的中央坏死将导致肿瘤体积测量大小跟荧光强度的采集出现不一致的结果,而肿瘤生物荧光的强度和激发荧光的强度均反映了肿瘤内活细胞的数量,故两者也呈现一定的相关性,但实验数据采集过程中我们发现,BLI成像的灵敏度明显高于FMI的成像灵敏度,在肿瘤接种早期,生物荧光相对激发荧光更能够精确地反映肿瘤细胞的生长状态。结论:1.裸鼠皮下和原位移植性肝癌模型具有操作简便、成瘤率高、肿瘤生长周期短、易于控制等优点,是研究肝癌生物学行为和筛选抗癌药物及诊疗方式的理想模型。2.肿瘤生物荧光强度和激发荧光强度和肿瘤体积均呈现高度相关性,可反映肿瘤内活细胞数量。3.光学分子影像技术可以实现无创、实时、动态、连续、直观地观测裸鼠活体内肝癌肿瘤的生物学行为。二、光学分子影像技术辅助下芹黄素对肝癌抑制作用的研究目的:1.光学分子影像技术辅助下研究芹黄素对肝癌的抑制作用,以期为发现新的肝癌治疗药物提供有益的参考。2.探索验证光学分子影像技术在观察药物抗肝癌疗效中的应用价值。方法:1.肝癌皮下肿瘤抑制实验将20只Balb/c裸鼠随机分为2组:对照组(生理盐水组)和实验组(芹黄素组),每组各10只,按照本论文第一部分介绍方法分别用HepG2-fLuc和HepG2-GFP标记的肝癌细胞悬液接种到裸鼠上肢左腋窝和右腋窝处建立肝癌皮下肿瘤模型。2.肝癌原位肿瘤抑制实验将20只Balb/c裸鼠随机分为2组:对照组(生理盐水组)和实验组(芹黄素组),每组各10只,按照本论文第一部分介绍方法分别用HepG2-fLuc标记的肝癌细胞悬液接种到肝脏包膜下建立肝癌原位肿瘤模型。3.给药方法待皮下和原位肝癌移植模型成功建立后开始根据各实验分组情况给予相应的不同药物处理:(1)对照组:每3天腹腔注射等容量的无菌生理盐水,共7次;(2)实验组:芹黄素50mg/kg,腹腔注射,每3天注射1次,共7次。4.各组比较和检测指标每天观察裸鼠的体重、精神状态、饮食情况、活动规律及排便等一般情况观察。IVIS 200分子影像系统测量肿瘤荧光强度变化,三维重建测量肿瘤体积变化,并绘制比较各组肝癌移植瘤体积和荧光强度增长曲线。5.动物处置与标本获取待全荷瘤鼠死亡后,剥离瘤体,观察大体形态并称取瘤重,将各个瘤组织分成两部分,一部分固定包埋后做病理检查,余下的瘤组织放一80℃冻存。6.统计学处理:连续变量采用均数±标准差(mean±SD)表示,组间整体比较采用重复测量资料的方差分析,单独时间点比较采用独立样本t检验。用Kaplan-Meier法绘制荷瘤裸鼠生存时间并用log rank检验比较。数据分析采用IBM SPSS 19.0软件分析,P0.05认为差异有统计学意义,Prism5.0软件绘制图表。结果:1.裸鼠一般情况20只皮下肿瘤裸鼠接种肝癌细胞10天左右,出现粟粒大小的类圆形结节,高出皮肤表面,质韧,可活动,以后结节逐渐增大,移植成功率为100%。20只原位肿瘤裸鼠接种肿瘤细胞时术中死亡4只,由相应数量裸鼠补齐。皮下和原位肿瘤在接种后20天内,肿瘤增长速度较缓慢,裸鼠精神良好,反应敏捷,饮食、大小便及活动正常,皮肤颜色如常,移植瘤组织未见破溃:在接种之后的第21到30天期间,肿瘤增长速度开始加快,裸鼠的精神状态较之前开始变得萎靡不振、活动减少、反应迟钝、消瘦等;从第30天以后,肿瘤增长的速度更加迅速,以对照组肿瘤增长速度最快,裸鼠变得愈加萎靡不振,基本上不活动,饮食和饮水量急剧减少,身体变得愈加消瘦。2.芹黄素抗肝癌肿瘤作用(1)裸鼠肝癌皮下肿瘤实验待肝癌移植模型成功建立后按分组情况开始给药,治疗开始后每天测量移植瘤体积及相应荧光强度值,并绘制移植瘤体积和荧光强度增长曲线。绘制荷瘤裸鼠成瘤20天后实验组和对照组两组肿瘤(包括HepG2=fLuc和HepG2-GFP两种细胞标记的皮下肿瘤模型)各时间点肿瘤体积和荧光强度增长曲线可以得出,BLI和FMI信号强度值在各时间点实验组显著低于对照组,并且始终保持这种抑制状态。在肿瘤接种后第45天抑制作用最为显著,芹黄素在瘤重、肿瘤体积及荧光强度方面均表现出对裸鼠皮下肿瘤的抑制作用。裸鼠死亡后,剥离瘤体,观察其大体形态可见:肿瘤呈结节状,包膜完整,血供丰富,切面呈灰白色和少量出血坏死灶,无周围组织浸润。①.组间整体比较:A.在BLI皮下肿瘤体积方面,可以看出实验组分别在第20d、25d、30d、35d、40d、45d 6个时间点均低于对照组,对两组各时间点荧光值进行重复测量资料的方差分析,组间因素的比较,即实验组与对照组相比,F=579.544,P=0.000,两组差异有统计学意义。B.在BLI皮下肿瘤荧光强度方面,可以看出实验组分别在第20d、25d、30d、35d、40d、45d6个时间点均低于对照组,对两组各时间点荧光值进行重复测量资料的方差分析,组间因素的比较,即实验组与对照组相比,F=293.045,P=0.000,两组差异有统计学意义。C.在FMI皮下肿瘤体积方面,可以看出实验组分别在第20d.25d.30d.35d.40d、45d 6个时间点均低于对照组,对两组各时间点荧光值进行重复测量资料的方差分析,组间因素的比较,即实验组与对照组相比,F=109.346,P=0.000,两组差异有统计学意义。D.在FMI皮下肿瘤荧光强度方面,可以看出实验组分别在第20d、25d、30d、35d、40d、45d 6个时间点均低于对照组,对两组各时间点荧光值进行重复测量资料的方差分析,组间因素的比较,即实验组与对照组相比,F=422.243,P=0.000,两组差异有统计学意义。②.单独时间点比较:A.在HepG2一fLuc标记的皮下肿瘤模型中,实验组和对照组在肿瘤细胞接种后第45天时肿瘤瘤重、肿瘤体积和BLI荧光强度比较,实验组在肿瘤瘤重(0.519±0.076g vs 0.859±0.114g,t=7.862,P=0.000).肿瘤体积(400.80±37.154mm3vs 624.30±39.797mm3,t=12.981,P=0.000)和BLI荧光强度(4543000.00±401221.745 photons/cm2 vs 6994000.00±395592.383 photons/cm2,,f=13.756,P=0.000)方面均显著低于对照组,两组差异均有统计学意义。B.在HepG2-GFP标记的皮下肿瘤模型中,实验组和对照组在肿瘤细胞接种后第45天时肿瘤瘤重、肿瘤体积和FMI荧光强度比较,实验组在肿瘤瘤重(0.447±0.939g vs 0.756±0.117g,t=7.779,P=0.000)、肿瘤体积(373.50±31.160mm3 vs 564.20±42.512mm3,t=11.441,p=0.000)和FMI荧光强度(3.51×109±2.456×108 photons/cm2 vs 4.47×109±1.677×108 photons/cm2,t=10.206,P=0.000)方面均显著低于对照组,两组差异均有统计学意义。C.而在体重方面实验组和对照组两组差异无统计学意义(19.700±2.540g vs19.830±2.239g,t=0.121,P=0.905)。(2)裸鼠肝癌原位肿瘤实验:①.组间整体比较:肿瘤成瘤5天后各时间点实验组和对照组两组原位肿瘤体积和BLI荧光强度增长曲线A.在原位肿瘤体积方面,可以看出实验组在各时间点均低于对照组,对两组各时间点荧光值进行重复测量资料的方差分析,组间因素的比较,即实验组与对照组相比,F=293.045,P=0.000,两组差异有统计学意义。B.在BLI荧光强度方面,可以看出实验组在各时间点均低于对照组,对两组各时间点荧光值进行重复测量资料的方差分析,组间因素的比较,即实验组与对照组相比,F=1342.145,P=0.000,两组差异有统计学意义。以上均说明芹黄素对肝癌具有明显的抑制作用。②.单独时间点比较:A.实验组和对照组在肿瘤细胞接种后第5天时肿瘤体积、荧光强度比较,实验组在肿瘤体积(29.10±5.405 mm3 vs 30.20±6.663mm3,,t=0.405,P=0.690)和荧光强度(349500.00±10394.977 photons/cm2 vs 349700.00±16193.620 photonS/cm2,t=0.033,p=0.974)方面两组差异无统计学意义。B.实验组和对照组在肿瘤细胞接种后第35天时肿瘤体积、荧光强度及裸鼠体重变化比较,实验组在肿瘤体积(161.80±16.212 mm3 vs 328.90± 9.949mm3.t=27.779,P=0.000)和荧光强度(865600.00±21613.782 photons/cm2 vs 1249000.00±5384l.331 photons/cm2,t=20.897,P=0.000)方面均显著低于对照组,而在体重方面(22.800±2.732g vs 18.740±1.585g,t=-4.065,P=0.001)实验组高于对照组,两组差异有统计学意义。结论:1.芹黄素对肝癌具有明显的抑制作用,为肝癌的综合治疗提供了新方案。2.光学分子影像技术能直接快速的测量肝癌肿瘤模型中肿瘤的生长、转移以及对药物的反应,在对药物的筛选和评价中具有重要应用价值。三、光学分子影像技术辅助下MRP2在ICG肝脏代谢中的作用研究目的:1.借助光学分子影像技术明确MRP2在ICG肝脏代谢中的作用。2.探索验证光学分子影像技术在肝脏病理生理学机制研究中的应用价值。方法:1.主要实验试剂注射用吲哚菁绿(ICG)和MRP2抑制剂MK-571。2.主要实验仪器IVIS 200非侵入式定量分子影像系统3.实验对象和分组取20只4-8周健康BALB/c小白鼠随机分为2组:对照组A组:ICG+生理盐水;实验组B组:ICG+MK-571,每组10只。4.动物活体成像记录方法小白鼠麻醉后,俯卧平放于IVIS分子影像系统的记录暗箱中。首先扫描并拍摄药物注射前动物活体成像图1张,实验组实验前1h行MK-571腹腔注射(注射剂量4mg/kg),然后进行ICG (0.5mg/kg)尾静脉注射,对照组注射等量的生理盐水和ICG,此后每10min进行一次小鼠荧光成像扫描并记录一张动物体内ICG荧光图像,分析ICG在肝脏的分布、代谢过程,连续观察90min并绘制代谢曲线图,分析动物体内荧光分布的改变和MRP2对ICG代谢的影响,并与对照组比较。为了研究ICG在小白鼠体内实验最佳注射剂量,预实验我们另用15只健康BALB/c小白鼠随机分为3组,每组5只,分别用三种不同ICG注射剂量(0.1mg/kg, 0.5mg/kg, 1.0mg/kg),在注射后第5min、10in、20min、40min、 60min、80min6个时间点分别测量ICG荧光强度值变化并绘制代谢曲线图,结果证实0.5 mg/kg为小白鼠体内实验最佳注射剂量。5.ICG肝脏内荧光发光强度的定量化分析采用Living Image(?) Software 4.0 for IVIS(?) Spectrum软件对各组各时间点的ICG肝脏荧光分布进行量化分析,了解各组各时间点肝脏ICG荧光分布的部位、范围和强度;用图像分析中的圆形区域即工具栏中的感兴趣区域(region of interest, ROI)选择程序提取各组肝脏区域荧光均值。分别计算各组各时间点肝脏荧光强度均值。6.统计学处理用IBM SPSS 19.0统计软件对两组各时间点荧光值进行重复测量资料的方差分析,结果以均数±标准差(mean±SD)表示,P0.05认为差异有统计学意义,Prism5.0软件绘制图表。结果:1.肝脏活体荧光成像图显示ICG注射即刻小鼠肝脏就有团状聚集的荧光显示,10min后达到最高值,注射后20-30min时,荧光强度一直保持在较高水平,到80min时,荧光已减至较弱的水平。整个观察过程与已知的ICG在肝脏代谢活动基本同步,说明应用在体荧光成像技术研究MRP2在ICG肝脏代谢中的作用是可行和可靠的方法。2.MRP2对ICG在肝脏代谢的影响在10min时,ICG荧光实验组即显示出比对照组增强的趋势,此趋势一直延续到观察结束。对两组各时间点荧光强度值进行重复测量资料的方差分析,组间因素的比较,即实验组与对照组相比,F=129.051,P=0.000,两组差异有统计学意义,结果说明,MRP2抑制剂MK-571显著延缓了ICG在肝脏的代谢时间,使荧光发光在肝脏持续时间延长。结论:1.MRP2抑制剂MK-571延缓了ICG在肝脏的代谢时间,说明MRP2是ICG在肝脏代谢的通道之一。2.小动物在体分子成像技术可以连续、实时、无损伤的对ICG在肝内代谢过程进行显示。四、光学分子影像技术在确定肝脏肿瘤位置及边界中的应用研究目的:借助光学分子影像手术导航系统进行前期动物实验及初步临床验证,以期利用该方法达到在术中快速、准确、客观的定位肝脏肿瘤及转移病灶组织的边界及判断肿瘤切除后断面有无残留病灶,达到精准、完整切除肿瘤的目的。(一)前期动物实验方法:1.主要实验试剂注射用吲哚菁绿(indocyanine green, ICG)。2.主要实验仪器IVIS 200非侵入式定量分子影像系统光学分子影像手术导航系统(Surgical navigation system, SNS)3.实验对象和分组将30只Balb/c裸鼠分别用HepG2-fLuc标记的细胞接种到上肢左腋窝后随机分为2组:对照组(常规手术组)和实验组(SNS引导手术组),每组各15只。4.实验方法手术导航方法与常规方法对比切除裸鼠皮下肿瘤待肿瘤细胞接种裸鼠成瘤第45天后,将SNS摆设于裸鼠手术台前,固定好后设置固定参数,将近红外激发光源固定于离裸鼠手术台面约10cm距离,荷瘤裸鼠麻醉后,仰卧位固定,调整SNS系统,确保裸肿瘤区域在成像系统可拍摄的范围内,消毒,铺巾,用1ml注射器接头皮针(以确保容易控制ICG的注射剂量)抽取ICG0.2ml尾静脉注射,实时采集荧光及可见光图像,可以在显示器上观察到肿瘤显像,医生在图像的引导下,精确定位肿瘤位置及边界,显示为高荧光强度结节影判定为肿瘤,常规切开皮肤、皮下组织,切取高荧光强度结节(即肿瘤),术后缝合皮肤及皮下组织。整个手术过程中手动采集图像(术前、术中及术后),术后用Living Image(?) Software 4.0 for IVIS(?) Spectrum软件分析及处理实验图片。在常规手术组中,由同一位医生凭借经验切除裸鼠的皮下肿瘤,在肿瘤切除以后,通过腹腔注射荧光底物,观察是否有肿瘤残余。统计两组裸鼠术后肿瘤残余率和生存时间。5.组织病理验证将切下的肿瘤组织利用冰冻切片包埋剂(optimum cutting temperature OCT)进行包埋和连续切片,然后将组织切片用苏木精和伊红(HE)染色法进行染色固定。6.统计学分析连续变量采用均数±标准差(mean±SD)表示,对于计数资料,组间比较采用x2检验或Fisher's精确检验统计分析。用Kaplan-Meier法绘制荷瘤鼠术后生存曲线并用log rank检验比较两组生存时间。数据分析采用IBM SPSS 19.0软件分析,P0.05认为差异有统计学意义,Prism5.0软件绘制图表。结果:SNS手术导航组在肿瘤残余率(6.7% vs.46.7%,p=0.035)方面显著少于常规手术组,常规手术组裸鼠的生存天数最小值为19天,最大值为48天,生存均值为36天,生存中位数为38天,手术导航组裸鼠的生存天数最小值为43天,最大值为68天,生存均值为54天,生存中位数为54天,生存时间明显长于常规肉眼手术切除方法的裸鼠,两组比较差异有统计学意义(p=0.000),这也说明这种精确治疗可以有效的提高生存率,改善预后效果。(二)初步临床验证方法:1.研究对象选择对象为在南方医科大学珠江医院肝胆一科住院待手术病人。(1)入选标准:①术前影像学检查结合肿瘤指标诊断为肝脏肿瘤占位性疾病,具有明确的手术切除指征或手术探查指征。②综合评估后可耐受手术者;③签署知情同意书。(2)排除标准:①试刑“吲哚菁绿”皮试阳性。②有明确的手术、麻醉禁忌。③无人身自由及独立民事行为能力者。(3)剔除标准:①出现严重过敏反应者。②出现持续性过敏反应者。③受试者要求退出临床试验者。④研究者认为不宜继续参加本临床试验者。2、伦理学要求遵循赫尔辛基宣言和中国有关临床试验研究规范、法规进行。在试验开始之前,已通过本实验研究单位南方医科大学珠江医院伦理委员会批准认定。3.实验方法本研究采光学分子影像手术导航系统引导下的ICG对肝脏肿瘤患者进行肿瘤切除手术,将切除的病灶行病理检查,探讨其在肝脏肿瘤边界界定及发现残余病灶中的临床应用价值。4.实验流程①ICG的静脉注射剂量为0.5mg/kg。②ICG静脉注射的时间平均为手术前1天。③ICG注射到术中开始检测荧光间的时间窗口对无明确肝硬化表现患者为24小时;对于可能存在肝硬化的患者为24-48小时。原因是肝功能不良时,肝脏组织对ICG的排泄也会减慢,这就需要相应的延长窗口期。④术中侦测:检测设备在距离手术野60cm处进行侦测,不会污染手术野。5.安全性评价试验中密切观察不良事件观察并评价,对临床出现的不良反应,需随访至症状消失。结果:自2014年12月到2015年3月,共5例病人在我院实施了在光学分子影像手术导航系统引导下的肝脏肿瘤切除术,其中3例为肝细胞癌,1例为转移性肝癌,1例为局灶增生性结节。所有受试者在提供书面知情同意后,医生对实验流程进行充分解释。所有患者术前均行腹部超声和增强CT检查及皮下ICG过敏测试。5例患者原发肿瘤病灶在光学分子影像手术导航系统下均显示明亮的荧光信号,从而可快速、准确定位肿瘤位置,引导医生进行准确切除,所有注射ICG的患者均未出现副作用。结论:利用光学分子影像手术导航的方法可以对肝脏肿瘤进行术中精确定位,明确的显示出肿瘤的边界,同时可以在术中帮助医生判断肿瘤切除后断面有无残留病灶,以及判断是否有转移。


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