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缓释普伐他汀的壳聚糖/明胶复合血管组织工程支架材料的研究

冯婕  
【摘要】:心血管疾病已经成为威胁人类生命,影响人类生活质量的元凶之一。对于病情较为严重的患者来说,最常用的治疗方法是血管移植治疗。因此,血管移植物的来源成为人们所关注的内容。血管移植的基本要求包括具有良好的生物相容性、不产生血栓和具有一定的机械强度。目前,临床上常用的血管移植物主要有自体血管、异体血管和人工合成血管,自体血管来自于人体本身,具有很好的生物相容性,因此可以避免免疫排斥反应。但是由于自体血管来源不足,很大程度上限制了其使用。而异体血管由于免疫排斥反应严重、细胞脱落等原因,也无法得到广泛应用,尤其异种异体移植还存在伦理学问题。人工合成血管早期主要是由膨体聚四乙烯,涤纶,聚氨酯等制备,不适用于小口径血管,容易出现血栓栓塞、狭窄、钙沉积等,不能降解,不具有生物活性和自我重塑的功能。如何既能修复病损,又能防止复发是本研究的出发点。组织工程概念的提出为血管移植提供了很好的思路,将细胞与生物可降解支架复合培养,移入体内,随着支架的移入和降解、最终再生构建成具有生理功能的新血管。为了促进受损器官的修复,研究者们大多致力于如何促进组织生长,但心血管疾病具有高复发的特点,还常伴随较高的手术并发症。因此本研究旨在研制一种在再生修复病损血管的同时,能防止病损复发降低手术并发症的血管组织工程支架。他汀类药物是一类3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-COA还原酶)的竞争性抑制剂,具有显著降低血脂、抗炎、抗凝血、加速受损血管内皮化、减缓或减退动脉粥样硬化斑块的发展等作用,可用于血管重建手术后的再狭窄防治,并降低血管手术并发症。普伐他汀是一种水溶性他汀,在体内无需代谢转化就能具有药理活性,不良反应少。目前他汀类主要通过口服给药,半衰期较短,生物利用度较低,在胃酸环境下不稳定,容易转化为活性只有普伐他汀1/10-1/40的异构体。本研究将缓释技术引入组织工程支架,先制得可以长效释放普伐他汀的壳聚糖微球,随后将其载入到以明胶/壳聚糖为基质的三维多孔支架,旨在研制一种在再生修复病损血管的同时,能防止病损复发、降低手术并发症的血管组织工程支架材料;由于植入体内后普伐他汀能从支架中释放,直接作用于心血管系统,因此可望显著提高其生物利用度。京尼平是一种天然的生物交联剂,能与壳聚糖、明胶形成稳定的化合物,因此在制备过程中采用了京尼平作为交联剂本文以壳聚糖为载体材料,以京尼平为交联剂,采用乳化交联法制备了包载普伐他汀钠的微球。首先,对壳聚糖进行纯化处理,对制备壳聚糖微球的壳聚糖分子量,交联剂的滴加方式,水油比例,反应温度,机械搅拌速度,搅拌时间,交联剂的浓度等方面进行考察以得出制备微球的最佳工艺条件。所得出的最佳工艺条件为:将一定量的中粘度(200-400mPa.s)壳聚糖溶于1%的醋酸溶液中,保持反应温度为40℃,油水比例维持在10:1,搅拌速度为850r/min,将配置好的京尼平溶液分两次等量滴加到反应体系中,每次滴加的时间控制在25-30min,并将所得到的产物离心后,分别用石油醚、丙酮、异丙醇分别进行洗涤,最后将收集到的产物进行真空干燥。通过扫描电镜观察所制备微球的形貌,从扫描电镜我们可以看出,经过优化条件后所制备的微球表面光滑,分散性好,形状均一,而且随着交联时间的延长,可以观察到微球形状越来越规整。过高或过低的交联剂浓度都会对微球的形状产生不良影响。微球溶胀度测试结果表明:当微球的交联时间越长或者交联剂浓度越高,微球的溶胀度就越小;而将微球浸没于不同pH溶液中,随着溶液pH的升高,微球的溶胀度逐减小,如交联4h,采用京尼平浓度为13g/L的微球来说,但pH为2时,微球的溶胀度为332.4%,而随着pH的升高,溶胀度逐渐减小,当pH达到10时,溶胀度降低到237%。马尔文粒度仪测定空白微球及载药微球的粒径分布,载药前后粒径变化不大采用红外光谱(FTIR)分别对壳聚糖,普伐他汀钠及载药前后的壳聚糖微球及投药量不同的壳聚糖微球进行表征,根据峰位的改变来证明药物是否被载入到微球中。经测定,普伐他汀钠被成功载入微球中,其载药率为27.4%。最后对交联不同时间,滴加不同京尼平浓度的微球进行体外释放研究得出,随着交联时间的延长及京尼平浓度的增加,药物的释放逐渐变慢。交联时间6h-48h,京尼平浓度均为13g/L制备的微球57天的累计释放量为6.3-30.3%;而交联时间均为24 h,京尼平浓度为1.3-13g/L时,微球在57天内的累计释药量为7-26.9%。因此普伐他汀钠缓释微球具有很好的缓释作用。并且药物的突释现象也并不明显。通过对降解105天的微球形貌进行SEM观察,可见微球出现一些溶蚀小孔,表明此时微球骨架已经开始降解,从而使得药物进一步释出,而更早期的释药应该是由于壳聚糖微球在溶液中的溶胀所致。以壳聚糖、明胶为基质,通过冷冻干燥法制备包载有普伐他汀钠壳聚糖微球的壳聚糖/明胶血管组织工程支架。在制备过程中分别采用京尼平和EDC/NHS作为交联剂,考察所制得的三维血管组织工程支架的微观形貌,孔隙率,酶降解率以及载药支架的体外释药情况。实验中发现,采用京尼平作为支架交联剂得到的支架性能更加。SEM结果显示,制得的支架具有良好的孔状结构,当壳聚糖与明胶的比例为2:3时,支架的形态与孔径大小最为理想。所得到的支架孔隙率为81.9%-96.1%,随着交联剂浓度的增加,孔隙率略有降低,比较两种支架制得的支架的酶降解率,发现以京尼平为交联剂制得的支架酶降解速率远远慢于以EDC/NHS为交联剂的情况,表明京尼平更适合用于制备血管支架材料;载药支架的体外释药结果显示,释药40天,药物仍然持续释放,累计释药率为4.1%-24.6%,壳聚糖微球的交联时间越长,支架的释药速率越慢。因此可以通过控制微球交联时间来调整药物释放速度。载药支架体外体外释药结果表明,本研究制备的载药壳聚糖/明胶组织工程支架可以长效释放普伐他汀。进行了初步的细胞实验,细胞毒性实验表明,将支架浸提液与人脐静脉内皮细胞HUVECs共培养2天,通过MTT法测定其细胞毒性,结果表明,以不同基质比例制备的支架以及用不同浓度的京尼平EDC/NHS制备的支架的相对增值率(RGF)均大于75%,根据细胞毒性试验ISO10993制定的评价标准,所制得的的载药三维血管组织工程支架具有良好的细胞相容性。将组织工程支架与细胞进行共培养4天,结果显示,本研究制备得的载有普伐他汀钠的组织工程血管支架对人脐静脉内皮细胞HUVECs的生长没有不良影响。


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