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脂肪组织提取物对组织工程室内构建物早期血管形成及成脂化影响的研究

卢子敬  
【摘要】:研究背景和目的临床上因为肿瘤切除术后、先天性畸形及外伤等各种原因引起的软组织缺损及因美容需求的软组织填充是整形修复美容外科面临的重大挑战之一。2011年美国有近5百万例的修复重建手术,78%为修复重建肿瘤切除术后的软组织缺损。全球范围内每年大约有130万的乳腺癌新发病例,乳癌切除后必将造成大范围软组织缺损。为解决以上难题,真皮移植、人工合成材料、胶原注射剂及自体脂肪移植等被越来越多的的应用于临床工作中。而这些方法都有各自的缺点和不足,比如合成材料容易引起机体的异物反应和感染;脂肪组织因能够提供容量和轮廓支持而受到临床医生的青睐,但其吸收率高达30~50%,限制了其在临床上的应用;带蒂脂肪瓣移植由于其移植后,应用显微外科技术即刻重建脂肪内部的血液循环,移植后体积缩小少,能取得移植的最佳效果,但带蒂脂肪供区有限,切取大量脂肪后易导致供区继发畸形,这限制了带蒂脂肪瓣移植在临床的应用。近年来脂肪组织工程技术为解决软组织缺损的修复提出了全新的思路。在脂肪组织工程中细胞、支架和微环境是三个主要因素,但不管是通过优化种子细胞或者改性生物活性材料支架或者改善局部微环境,最终构建的工程化脂肪组织,其体积都无法超过1ml,并且在组织构成和组织稳定上都难以达到满意的结果。2003年Hofer SO等人移植轴型血管蒂到一个充满胶原基质的生物惰性材料制作有一定硬度的保护性容器内,为拟构建的组织提供血运基础、营养物质和生长所需空间,生成了非特异性的肉芽组织,首先提出“血管化组织工程室”的概念。这种创新型的构建模式为我们的组织工程研究大大拓宽了思路。随着研究的深入,2007年Dolderer等人把带血管蒂的腹壁脂肪瓣放入中空的小室内植入老鼠的腹股沟皮下,发现脂肪组织显著增长,组织形态学分析显示增加的组织是正常的血管化成熟脂肪组织,形成了“脂肪组织工程室”。2011年将这种方法应用到大动物,体积最大达56.5ml,然而所产生的脂肪组织的体积未达到置入工程室的容积,生长受到限制,并且组织形态学研究发现其组织成分为;纤维结缔组织、脂肪组织、血管、PLGA,并且纤维结缔组织的量和脂肪组织的量是相同的。我们手术治疗软组织缺损的目的不仅仅是为了填充凹陷,更重要的是要形成具有自然外观和美学功能,并且与身体周围组织结合并长期维持稳定的自然组织。显而易见,脂肪组织工程内所构建的脂肪组织并不完全适合应用于临床实践中。随着深入的研究,目前认为工程化脂肪组织的体积主要取决于:一、早期的快速血管化,这是限制组织工程技术最终构建物体积以及组织结构成熟的关键因素;二、可控降解、组织相容性良好的生物材料;三、利于符合构建物发构建物发展的微环境;四、稳定的物理屏障以保障构建物体积和组织形态的长期稳定。脂肪组织本身具有很独特的生理结构,脂肪组织中除了丰富的血管网络之外,90%的空间由高耗氧、高耗能的脂肪细胞构成,同时作为机体重要的内分泌器官,脂肪组织能分泌多种脂肪因子,并且拥有丰富的生长因子和细胞因子,同时参与了血管化和脂肪化的过程。Jertta-RiinaSarkanen等从成熟的脂肪组织中提取的脂肪组织提取物(ATE)包含各种成熟脂肪组织的生长因子和细胞因子,在体外能够诱导血管生成和脂肪生成。那么能否在工程室内局部增加一些促进血管化或成脂化的因子促进早期构建组织的血管化这个关键问题,来改善组织工程室构建物生长受限的情况?是否能影响最终新生构建物的组织形态和成熟程度呢?归根结底来说,就是如何利用组织工程室模型,最终诱导较纯化的工程化脂肪组织。围绕这几个科学问题,本实验拟将脂肪组织提取物注入到兔组织工程室内,通过对组织工程室内渗出液进行生化检测分析,揭示工程室内环境的变化,而后观察工程室内构建组织的组织学形态变化及血管化情况,探讨通过加强早期的血管化,能否构建较纯化的工程化脂肪组织。方法1、脂肪组织提取物对血管和脂肪生成的诱导利用兔腹股沟的脂肪组织,将其分离培养24小时,过滤,离心后提取上清液,ELISA检测相关因子,并将脂肪来源干细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞加入到中提取的脂肪组织提取物(ATE)中,观察其对成脂化和成血管的作用2、脂肪组织提取物注入工程室内观察组织工程室内构建组织的变化构建兔脂肪组织工程室模型,实验组:在模型构建后将脂肪组织提取物1周后注入一侧工程室内,对照组:另一侧注入等量的生理盐水。分别于不同时间点观察脂肪组织工程室构建物的大体及组织学变化过程,并检测脂肪组织工程室渗出液中细胞因子及生长因子的变化。3、统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示,使用统计软件SPSS 13.0进行数据处理。两组之间比较采用配对t检验;不同时间点的差异采用协方差分析。P值小于0.05说明具有统计学意义。结果1、脂肪组织提取物(ATE)加入到到联合培养的血管内皮细胞和成纤维细胞的培养基中,血管形成实验显示ATE组血管内皮细胞形成连续的网状结构。ATE加入脂肪来源干细胞中(ASCs)的培养基中,油红O染色显示,ATE组ASCs在无成脂诱导的情况下,细胞内出现明显的脂滴聚集。2、脂肪瓣的体积在注入ATE后3天、1周、2周、3周、4周、7周时,早期构建组织成胶冻状,后期软组织表面可见明显包膜形成,触之较韧。注入ATE后,实验组新生组织体积较对照组明显增大3、在脂肪组织发展过程中开始阶段,对照组组和实验组均有大量新生小血管出现在间质区域,实验组组比对照组新产生的小血管密度大。随着时间推移,对照组和实验组注入组新生组织边缘纤维沉积中有大量新生血管岛状样脂肪细胞新生,实验组中边缘纤维沉积中有大量的新生的幼稚脂肪细胞,而对照组中只有零散的分布,脂肪新生提前,并且血管化逐渐成熟。后期两组新生组织已形成正常的脂肪组织小叶样结构。观察构建物的外层形成的薄膜发现,实验组新生脂肪组织边缘包膜较对照组更薄,结构排列更为规则4、CD31免疫组化发现,早期血管新生和数量明显增多,注入ATE后1周总的毛细血管的数量是最高的,并且实验组较对照组多。讨论组织工程室模型诱导脂肪新生的模式可看作为独特的脂肪组织创伤修复的过程。脂肪瓣从原位分离出带蒂岛状脂肪瓣后,脂肪组织连续性被打破,从而导致正常血管功能受损。机体启动非特异性的创伤修复,主要表现为三个相互独立又相互重叠的时期:炎症期,增殖期和组织重塑期。在小室内的早期炎症反应,大量组织液渗出,局限在小室内部,形成暂时性的结构性支撑。同时,高密度的中性粒细胞、巨噬细胞从血管中游离至填满小室的组织间液中,并分泌大量促血管生成和趋化因子。这对血管生成和早期骨髓间充质干细胞迁移和增殖起到起始趋化的作用。血管内皮生长因子(VEGF)最初被称为血管通透性因子,它被认为是内皮细胞增殖和迁移的强力刺激因子。成纤维细胞生长因子2(FGF-2)对于伤口愈合和血管生成很重要。作为血管生成的细胞因子,成纤维细胞生长因子2(FGF-2)能够促进内皮细胞增殖和毛细血管的形成,与此同时,也刺激间充质细胞的增殖和迁移。John A.Rophael等将VEGF、血小板来源生长因子(PDGF-BB)、FGF-2混合后加入到含有单纯血管蒂和Matrigel的小室中后发现加入的生长因子作用于早期。纤维组织中细胞浸润的数量增加,这些细胞主要包括巨噬细胞、周细胞、各种前脂肪细胞族群。而其中巨噬细胞和周细胞与血管和脂肪的生成均有关。同时研究发现加入促血管生成因子能促进创伤修复。主要原因是早期的新生血管不仅为局部组织提供氧气和营养,还作为干细胞趋化迁移的主要途径。因此早期更好地建立完善的血供能够更好的促进组织再生。ATE中包含成熟脂肪组织的生长因子和细胞因子,如VEGF、bFGF,白细胞介素-6(IL-6),胰岛素样生长因子-1(IGF-1),瘦素,脂联素等,而一些脂肪组织来源的生长因子和细胞因子也能刺激血管生成和脂肪组织扩张所需的毛细血管网形成。我们将ATE注入小室内,发现早期小室内新生组织间质化明显,渗出的组织液形成凝胶样纤维蛋白原基质,出现明显的血管新生。与此同时,血管周围出现许多幼稚脂肪细胞,提示机体间充质干细胞募集迁移至小室组织并在局部微环境诱导下启动分化。随着新生血管的逐渐成熟,并与机体固有血管形成完善的血管网络后,炎症反应逐渐减轻,组织修复进入增殖期。在实验组的这个阶段中,我们观察到大量新生血管网络形成。在早期形成的纤维蛋白原基质中出现大量孤岛样脂肪细胞分化增殖,并逐渐融形成新的脂肪小叶。不同分化阶段的脂肪前体细胞和脂肪细胞依附于血管周形成脂肪新生的基础。这个阶段实验组更早的形成更多地岛状脂肪细胞新生,一方面可能因为炎症期时在ATE的促血管生成因子的作用下,更多更快的血管网络在组织间液形成的纤维蛋白原基质中形成,致使更多的间充质干细胞通过循环进入小室内参与脂肪组织诱导新生;另一方面可能因为在增殖期ATE中含有的促脂肪生成因子,如瘦素,胰岛素样生长因子等,能更好的促进趋化迁移来的间充质干细胞增殖并诱导向成脂系细胞方向的分化。随着构建组织的成熟进入了重塑期,在血管生成的过程中伴随着血管的重塑,这个过程中血流不通,这就解释了为什么在注入ATE后2周对照组和实验组血管的密度下降。新生脂肪组织的结构逐渐形成正常脂肪组织的小叶状结构工程室内新生脂肪组织体积都小于工程室的实际体积,并且构建组织的最外层包绕着一层致密的纤维包膜,目前工程室模型多采用硅胶材料小室,这层纤维包膜可能和隆胸时假体表面形成的包膜相似。对于包膜形成的原因尚不明确,可能是由填充材料的性质、假体置入技术、假体表面的纹理、异物的存在(如手套上的滑石粉)、细菌感染等引起的,而对包膜挛缩的治疗也是没有固定的治疗方案。包膜分3个细胞层,每层都有自己的血供。有文献指出通过改善局部血管化能够重塑邻位组织,改善包膜质地。有实验研究利用干细胞疗法重建缺血组织血运以减轻包膜挛缩。也有学者利用脂肪移植来减轻包膜挛缩的程度,可能是因为脂肪组织中的间充质干细胞能分泌血管生成因子而促进内皮前体细胞进入新形成的血管中,改善包膜局部的血供,从而减轻包膜挛缩的程度。通过组织学染色,我们发现实验组工程室内新生组织最外层包膜比对照组薄,可能是因为早期更好的血管化导致后期包膜变薄。而包膜反应的减轻能够减少对新生组织体积增大的束缚,致使后期新生组织进一步增大。通过我们的实验对工程室内渗出液的连续观察,我们发现脂肪工程室内组织渗出液中含有大量的生长因子,注入ATE后渗出液中的生长因子的浓度增大,这些组织液能提供能更好的促进构建物的血管化和成脂化,提供更好的环境来支持脂肪组织的生长。脂肪组织工程室具有重要的的应用前景,脂肪组织来源丰富,供区损伤小,工程室不仅为室内组织提供了生长所需的空间,而且构建出的相对独立的空间便于实验的干预,局部应用脂肪组织提取物,加速室内组织的生长,又不影响全身的组织,这可能是未来利用组织工程室进行体内组织工程研究的重点。结论1、利用兔腹股沟脂肪垫提取的ATE能够改善工程室内的血管微环境,早期诱导大量血管网络新生、成熟,更快建立完善血供,促进脂肪组织新生。2、同时通过改善局部血管化减轻包膜反应,去除阻止新生组织体积进一步增大的障碍,为构建有利于临床应用的工程化的脂肪组织提供新的思路。


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