收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

致腹泻奇异变形杆菌毒力因子研究及应用

石晓路  
【摘要】:奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)是一种能引起泌尿系统感染的常见致病菌,但该菌已知的毒力基因与腹泻关系尚不明确,如何引起腹泻尚无定论。目前国外针对奇异变形杆菌的研究主要集中于引起泌尿系统感染的菌株中,对耐药研究较为多,但对奇异变形杆菌致腹泻的相关机制研究,Pubmed收录的论文很少。我们在部分食物中毒事件中,从病人腹泻标本和剩余食品中都分离到奇异变形杆菌,未分离到其他致病菌。同一批次分离株皆具有相同的脉冲场凝胶电泳(PFGE)型别,感染小鼠后能造成腹泻或死亡。而从健康人群与外环境分离的菌株不引起小鼠出现以上症状,其PFGE图谱间差异较大。由此提出假设,除了已知的毒力基因外,致腹泻的奇异变形杆菌的基因组中可能还存在着其它特异的毒力因子,是造成食物中毒的主要原因。围绕以上线索,本文主要开展以下几方面的研究:(1)致腹泻奇异变形杆菌病原学和分子生物学特征分析;(2)全基因组测序分析比较获得仅存在于致腹泻菌株中的特异基因;(3)在致腹泻菌株C02011中新发现的Ⅳ型分泌系统(T4SS)毒力岛编码基因virBl-11基本特性分析;(4)构建奇异变形杆菌C02011的virB9基因缺失株及回补株,鉴定其基本属性;(5)黏附和侵袭实验敏感细胞株的筛选,体外细胞模型的建立;(6)体外比较野生株C02011、virB9基因缺失株及回补株对人结肠癌Lovo细胞的黏附和侵袭水平;(7)腹泻动物模型的建立和初步实验;(8)明确virB9基因是否影响奇异变形杆菌对小鼠的致病能力。(9)特异基因的荧光PCR诊断方法的建立与菌株筛查。方法与结果:一、致腹泻奇异变形杆菌病原学、分子生物学特征1、选择6株奇异变形杆菌作为实验研究菌株,包括2株标准菌株:ATCC29906和HI4320;2株食物中毒分离株和2株健康人群和外环境拭子分离株。2、分析比较了不同来源的奇异变形杆菌的病原学特征和分子特征,不同来源的奇异变形杆菌生化特征基本相同,且均具有常见的毒力基因ureC、rsmA、 hpmA和zapA。说明这些基因没有特异性,不能区分致病菌株和非致病菌株。3、利用PFGE方法对奇异变形杆菌分子分型,同一起食物中毒分离株(病人标本和剩余食品分离株)的PFGE图谱一致,说明可能是由奇异变形杆菌引起的食物中毒。4、发现奇异变形杆菌中分别存在着1-3个不同大小的质粒。最大的质粒为10100bp左右,在所有菌株中普遍存在。而C05028和C02034中都存在着一个2683bp的小质粒,有四个开放读码框,其中645bp的qnrD基因为喹诺酮耐药基因,与耐药表型一致,可见该质粒与菌株的耐药性相关。5、环境分离菌株C02034携带的质粒最多(3个),其耐药性也最强,对喹诺酮类、磺胺类、氨基糖苷类和p-内酰胺类青霉素等均为耐药,由此推论其携带的另2个质粒也可能编码耐药基因,有待进一步验证。6、研究表明,凭借传统的生化分析及常见的毒力基因鉴定不能区分菌株的来源,无法确定是食物中毒菌株还是健康人群自身携带(或外环境中存在)的菌株;但PFGE和质粒分析可区分菌株来源。本研究还发现了奇异变形杆菌菌株中普遍存在的质粒,为奇异变形杆菌耐药及致病性研究提供了理论依据。二、奇异变形杆菌全基因组测序和序列比对1、为了进一步明确致腹泻菌株中的特异基因,收集了2株典型的致腹泻菌株(C05028和C02011),与1株健康人分离株(B02005)及1株外环境对照株(C02034)一起进行全基因组测序。2、通过序列比对分析,发现了仅存在于食物中毒株而非致病菌株中不存在的特异基因有7个,其功能预测结果显示这些基因有些编码溶血素,有些编码DNA核苷酸转移酶或糖基转移酶,有些是与真核细胞结合相关的转录调控原件,具体的功能有待进一步研究。这些基因为本研究首次发现,未见相关文献报道。3、在食物中毒分离株C02011中还发现了编码Ⅳ型分泌系统(T4SS)的特异基因,在奇异变形杆菌中目前尚无相关文献报道,是本课题组在食物中毒株中的首次发现。三、C02011中的Ⅳ型分泌系统(T4SS)基本特性分析针对C02011中的Ⅳ型分泌系统(T4SS)的11个基因virB1-virBll,通过同源比对、蛋白质功能域、三维结构预测、进化树、点阵图、基因结构预测、基因岛结构分析等,研究了整体的水平基因转移事件的进化关系。奇异变形杆菌C02011的T4SS主要的成分是:裂解糖基转移酶(VirB1),能量转移(VirB3-4, VirB11),融合通道(VirB2, VirB5-VirB10,脂蛋白),以及细胞黏附(VirB3-4)。结论:T4SS所有的11个基因在蛋白质和核苷酸水平上与肺炎克雷伯菌PMK1和大肠埃希菌ECOR31的T4SS基因高度相似,但与8株已测序的奇异变形杆菌菌株的核苷酸不存在同源。因此可以推断:该基因岛是近期从与其密切相关的肠杆菌科微生物大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中水平转移而来的。而这个事件至少发生在奇异变形杆菌C02011从其他奇异变形杆菌菌株分化之后。四、奇异变形杆菌C02011株virB9基因敲除及特性分析为了研究virB基因在奇异变形杆菌致病中的相关功能,选择编码分泌系统融合通道的virB9作为研究对象,构建virB9基因敲除株Pmi/AvirB9。利用基因同源重组的原理,通过自杀质粒PCVD442及中间宿主SM10λpir,成功构建了缺失virB9基因的突变株。并构建携带有virB9基因的Pmi/△virB9回补株,为下一步研究打下基础。在营养丰富条件下,C02011及Pmil△virB菌体的菌落形成和生长能力、生化反应并无显著差异。因而突变株适用于研究该基因对感染相关毒力的影响。五、黏附和侵袭实验敏感细胞株的筛选,体外细胞模型的建立选用人结肠癌细胞(Lovo)与人结肠腺癌细胞(Caco-2)进行体外研究,分别比对奇异变形杆菌C02011(食物中毒病人呕吐物分离株)和B02005(健康人粪便分离株)对细胞的侵袭性与黏附性,选择确定合适的细胞实验模型。结果显示,食物中毒病人呕吐物分离株C02011对Lovo、Caco-2细胞具有很强的黏附性,健康人粪便分离株B02005对Lovo、 Caco-2细胞黏附性弱,两菌株间的黏附率差异具有统计学意义(P0.01)。侵袭性实验也显示了类似的结果,两菌株对Lovo和Caco-2细胞的侵袭率差异具有统计学意义(P0.01)。本研究证实分离自食物中毒伴腹泻症状病人的呕吐物中的奇异变形杆菌C02011具有很强的黏附力和侵袭力,在引起人和动物肠道疾病中发挥重要的作用。人结肠癌细胞(Lovo)具有更高的敏感性,适宜于研究奇异变形杆菌对其的黏附和侵袭能力。六、virB9缺失降低了奇异变形杆菌C02011对Lovo细胞的黏附和侵袭能力体外模型采用Lovo单层细胞,与野生株C02011的黏附率相比,Pmil△virB9黏附Lovo单层细胞能力显著降低,二者黏附率差异具有统计学意义(P0.001)。庆大霉素保护实验结果表明,突变株在侵袭水平上也表现出明显的降低,二者侵袭率差异具有统计学意义(P0.001)。Pmil△virB9转化入回补质粒后,突变株黏附能力和侵袭能力基本得到恢复。七、腹泻动物模型的建立和初步实验为了证明部分奇异变形杆菌的确能够引起腹泻并具有不同的毒力,并建立合适的动物模型,分别采用6株不同来源的奇异变形杆菌感染小鼠,观察粪便性状及小鼠死亡情况。在经口灌胃实验中,所有菌株均未引起小鼠死亡,但食物中毒分离株引起小鼠粪便形状改变。腹腔注射实验中,7小时后,从腹泻病人呕吐物中分离的奇异变形杆菌作用的小鼠全部死亡,且小鼠的粪便稀软,小鼠的大肠切片染色结果也证实了病理改变。而从健康人群粪便及外环境分离的奇异变形杆菌作用的小鼠未死亡,且小鼠形态活力都正常。本研究成功建立了奇异变形杆菌的小鼠腹泻模型,为后续毒力基因的功能研究提供了较成熟的实验动物模型。本研究证明了奇异变形杆菌食物中毒分离株的毒力比健康人群及外环境分离株的毒力强,能引起小鼠腹泻甚至死亡,造成大肠的病理学改变。八、virB9缺失降低了奇异变形杆菌C02011对小鼠的致病能力为研究确认virB9基因的功能,在已建立好的小鼠动物模型上进行体内试验,分别采用C02011野生株、virB9基因敲除株及回补株感染小鼠,观察感染动物后的腹泻症状及病理改变,鉴别比较三者的致病能力差异。实验结果证明:C02011野生株和回补株的毒力比virB9基因敲除株的毒力强,能引起小鼠腹泻,导致肠组织含水量增多,与生理盐水对照株相比有统计学差异(t=2.7764,P=0.0193),并能造成大肠的病理学改变。virB9基因敲除株未能引起小鼠腹泻,肠组织含水量与生理盐水对照株无统计学差异(t=0.2979,P=0.7783)。说明virB9缺失降低了奇异变形杆菌C02011对小鼠的致病能力。但大肠的病理切片显示仍有一定的炎性反应,说明virB9基因不是该菌株的唯一的毒力基因,缺失virB9的敲除株仍具备一定的侵袭小鼠肠组织的毒力。有待进一步实验证实。九、致腹泻奇异变形杆菌荧光PCR检测方法的建立本研究在新发现的特异的毒力因子基础上,通过PCR筛查选取了4个在食物中毒菌株中普遍存在的毒力基因作为靶基因,采用相同标签辅助-无引物二聚体(Hand, Homo-Tag Assisted Non-Dimer)系统与改良分子信标荧光探针,建立1管同时检测奇异变形杆菌4种毒力基因的多重实时荧光PCR方法。所建立的针对致腹泻奇异变形杆菌的多重荧光PCR方法可广泛用于食物中毒或食品污染物的快速检测,区分正常人群携带株(外环境污染菌株)和致腹泻菌株,简化和完善现有的国标诊断方法,节省人力物力,满足食物中毒快速准确的诊断和传染来源追踪,减少误判和漏检,保障食品安全和人体健康。统计学分析:数据均表示为均数±标准差.两组间的比较采用t检验,多重比较采用单因素方差分析。动物实验阳性率的比较采用Pearson卡方检验。P0.05认为差异有统计学意义,检验水准为a=0.05。数据分析采用SPSS 13.0软件。结论:引起腹泻的奇异变形杆菌与健康人群及外环境分离的奇异变形杆菌经过全基因组测序和比对分析,发现了仅存在于致腹泻菌株中的一些特异的毒力基因,尤其是发现了存在于腹泻伴呕吐的食物中毒病人分离株C02011中存在着Ⅳ型分泌系统(T4SS)。该T4SS所有的11个基因(virB1-11)在蛋白质和核苷酸水平上与肺炎克雷伯菌PMK1和大肠埃希菌ECOR31的T4SS高度相似,但与8株已测序的奇异变形杆菌菌株的核苷酸不存在同源。因此推断:该基因岛是近期从与其密切相关的肠杆菌科微生物大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中水平转移而来的。而这个事件至少发生在奇异变形杆菌C02011从其他奇异变形杆菌菌株分化之后。食物中毒病人呕吐物分离株C02011对Lovo、Caco-2细胞均具有很强的黏附性和侵袭性,健康人粪便分离株B02005对Lovo、 Caco-2细胞黏附性和侵袭性弱,两菌株间的黏附率和侵袭率差异具有统计学意义(P0.01)。人结肠癌细胞(Lovo)具有更高的敏感性,适宜于研究奇异变形杆菌对其的黏附和侵袭能力。通过基因敲除构建的virB9基因缺失株对Lovo细胞的黏附和侵袭力下降,对小鼠的致病性降低,差异具有统计学意义(P0.01)。因此推论T4SS系统是奇异变形杆菌C02011的特异毒力因子,该毒力岛在与真核生物的黏附和侵袭作用中发挥重要作用,可能是导致人体产生腹泻和呕吐的决定性因子。构成T4SS系统的其他几个组成基因的功能将是我们后续研究中需要探索的问题。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 裴标,刘玉娥,高峻,陶墨奎;嗜碱耐盐奇异变形杆菌病原学实验研究[J];中国食品卫生杂志;2001年02期
2 徐文杰,侯兰,尹克启,孔令武;奇异变形杆菌致病因素检测[J];中国卫生检验杂志;2001年02期
3 周霞,刘玉娥;嗜碱耐盐奇异变形杆菌的分离与鉴定及致病性研究[J];职业与健康;2002年11期
4 刘艳霞;刘蕾;刘俊康;邓渝;;低湿度培养诱生变形杆菌复杂群集运动增殖生长模式[J];微生物学杂志;2011年05期
5 陈伟峰;洪舒音;赵秀玲;胡群;;水产品中8株特殊生化型奇异变形杆菌的分离鉴定[J];安徽农业科学;2012年01期
6 谢静;贾庶捷;林於;;奇异变形杆菌蛋白质双向电泳条件的优化及评价[J];吉林大学学报(医学版);2012年06期
7 夏佩莹;;粪、尿中分离的奇异变形杆菌对泌尿系统的致病性[J];国外医学(微生物学分册);1987年02期
8 石小英,张沛智;从涮火锅生食品中检出奇异变形杆菌[J];中国卫生检验杂志;1996年02期
9 孟蔚,温宪芹,周国清,张荣新,李德臣;一起奇异变形杆菌引起的食物中毒报道[J];中国学校卫生;1998年06期
10 刘国璋,陈族武,李志雄,范春梅,周建华,温旺荣;奇异变形杆菌引发人猴腹泻暴发流行的调查研究[J];中国人兽共患病杂志;1998年06期
11 应春妹;何澄;汪雅萍;叶杨芹;张灏旻;;奇异变形杆菌产超广谱β内酰胺酶基因检测[J];中国感染与化疗杂志;2009年05期
12 陈淑惠;;奇异变形杆菌致败血症1例[J];检验医学与临床;2011年06期
13 肖西志;吴达;孙敏;邓明俊;岳志芹;高宏伟;朱来华;孙涛;吴信海;徐彪;梁成珠;张彦明;;应用奇异变形杆菌多克隆抗体提高沙门菌分离鉴定准确性的研究[J];中国兽医学报;2012年10期
14 张斐;张平;程纯;俞一兵;宗素琴;;奇异变形杆菌毒素研究[J];南通大学学报(医学版);1991年02期
15 范景利,彭展文,田珍广,李申龙;一起奇异变形杆菌引起的食物中毒[J];解放军预防医学杂志;1996年02期
16 王自普,杨国英,张志强;一株奇异变形杆菌引起幼儿腹泻的报告[J];河南预防医学杂志;1996年01期
17 易卫东,黄辉,袁泽涛,丛延广,徐启旺;奇异变形杆菌寄宿波动的动物实验[J];解放军医学杂志;1999年01期
18 刘蕾;刘艳霞;邓渝;刘俊康;;同株奇异变形杆菌存在不同生长状态[J];微生物学杂志;2011年04期
19 冯海杰;;结膜炎患儿眼部分离奇异变形杆菌1例[J];检验医学与临床;2011年23期
20 曹庆春;;奇异变形杆菌所致脑膜炎1例报告[J];陕西新医药;1978年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 应春妹;何澄;汪雅萍;叶杨芹;张灏旻;;119株奇异变形杆菌产超广谱β内酰胺酶基因检测[A];中华医学会第八次全国检验医学学术会议暨中华医学会检验分会成立30周年庆典大会资料汇编[C];2009年
2 范春梅;周建华;李志雄;;中西药合治猕猴奇异变形杆菌性腹泻的临床观察[A];中国实验动物学会第七届学术年会论文集[C];2006年
3 王慧;朱瑞良;谭燕玲;魏凯;王新建;孙振红;盛鹏程;;奇异变形杆菌与沙门氏菌双重PCR检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年
4 王玉燕;朱瑞良;;奇异变形杆菌引起肉仔鸡急性死亡的诊断与分离鉴定[A];山东免疫学会、山东微生物学会医学微生物学专业委员会、山东省医学会微生物学和免疫学专业委员会、山东省医药生物技术学会2001年学术年会论文汇编[C];2001年
5 汤继顺;苏世广;朱德建;陈胜;;奇异变形杆菌性羊腹泻病原学分析及耐药性探讨[A];2013中国羊业进展[C];2013年
6 樊毅;;奇异变形杆菌引起的食物中毒调查报告[A];重庆市预防医学会2005年学术交流会论文集[C];2005年
7 甄天河;宣长更;张幼芳;;奇异变形杆菌引起242人食物中毒的调查报告(摘要)[A];安徽省第二届第二次食品卫生与营养学术会议论文摘要汇编[C];1988年
8 周会民;张海霞;韩咏梅;;奇异变形杆菌引起的食物中毒[A];吉林省预防医学会学术年会论文集[C];2004年
9 张庆华;熊清明;肖琳琳;杨灏;杨先乐;;大黄鱼溃烂症的新致病菌——奇异变形杆菌[A];中国水产学会第五届青年学术年会摘要集[C];2004年
10 周会民;张海霞;韩咏梅;;奇异变形杆菌引起的食物中毒[A];吉林省预防医学会2003年预防医学学术研讨会论文集[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 石晓路;致腹泻奇异变形杆菌毒力因子研究及应用[D];南方医科大学;2016年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张永兵;槐花多糖对鸡奇异变形杆菌OmpA基因工程亚单位疫苗的免疫增强效果[D];山东农业大学;2015年
2 朱明华;鸡奇异变形杆菌的分离鉴定及生物学特性的研究[D];山东农业大学;2010年
3 谢静;奇异变形杆菌波动生长相关蛋白的筛选与鉴定[D];重庆医科大学;2013年
4 吴晓茹;奇异变形杆菌耐药性及亚胺培南不敏感株感染的临床特点研究[D];浙江大学;2014年
5 贾雄飞;奇异变形杆菌周期性群集运动研究[D];第三军医大学;2005年
6 陶胜来;临床分离奇异变形杆菌的耐药性及分子流行病学研究[D];安徽医科大学;2012年
7 王慧;鸡奇异变形杆菌致病性相关毒素检测及PCR检测方法的建立[D];山东农业大学;2011年
8 黄璇;水貂奇异变形杆菌分离鉴定及其OMPA基因克隆与原核表达[D];山东农业大学;2014年
9 金丽;奇异变形杆菌鞭毛蛋白质FliD和人染色体移动复合物的初步晶体学研究[D];重庆医科大学;2013年
10 崔国林;奇异变形杆菌的系统发育分析、在雏鸡体内分布规律及亚单位疫苗研制[D];山东农业大学;2013年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 国防科大 刘莲英;当心饭菜中的“定时炸弹”[N];大众卫生报;2002年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978