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Myocardin基因修饰脂肪干细胞移植治疗糖尿病大鼠ED的实验研究

张海波  
【摘要】:[背景和目的]干细胞移植在治疗ED的动物模型和临床研究中均取得了良好的短期疗效,但仍存在远期疗效不明、移植后干细胞流失、移植的干细胞难以准确示踪以及治疗机制不明等问题。本研究将探讨Myocardin(Myocd)对脂肪干细胞(ASCs)增殖、凋亡、分化的影响及其机制,随后将Myocd基因修饰的干细胞进行阴茎海绵体内注射,以期增强ASCs治疗ED的效果,延长ASCs在阴茎海绵体内的停留时间,改善阴茎海绵体平滑肌(CCSM)细胞的舒缩功能,并首次引入小动物活体成像技术对移植干细胞进行活体示踪,为深入探讨基因修饰干细胞治疗糖尿病性ED(DMED)丰富理论基础。[方法]分离、培养、鉴定大鼠ASCs,构建同时携带Luciferase和Myocd的腺病毒载体并转染ASCs,CCK-8、EdU、AnnexinV和Ⅰ型胶原细胞收缩实验分别观察Myocd对ASCs增殖、凋亡、分化的影响,激光共聚焦(Confocol)观察Myocd和SRF在细胞内的定位,以及平滑肌骨架和收缩蛋白α-SMA、Calponin,干细胞干性标志物SOX2、OCT4的表达水平以探讨Myocd促进ASCs向平滑肌样细胞分化的分子机制;动物实验分为4组,即正常对照大鼠,DMED注射ASCs + Ad-Luc-Myocd,DMED注射ASCs + Ad-Luc和DMED注射PBS。小动物活体成像和EdU法示踪移植的ASCs,ICP/MAP测定各组大鼠勃起功能,HE、Massons’染色、TUNEL、免疫组化、WB检测组织形态学、纤维化、平滑肌含量、组织凋亡等改变。[结果]细胞实验中,ASCs CD29、CD90表达率在99%以上,并成功向成脂、成骨细胞分化;CCK-8、EdU提示转染Myocd的ASCs增殖速度下降、增殖细胞率减少,Ⅰ型胶原细胞收缩实验可见Myocd组细胞收缩力增强,AnnexinV证实二组间细胞凋亡数低且无明显差异;qRT-PCR、WB示Myocd转染ASCs使PCNA、SOX2、OCT4mRNA和蛋白表达水平下降,而α-SMA、Calponin、SRF表达上升;Confocol见Myocd与SRF在ASCs细胞核内共定位,过表达Myocd时,SRF、α-SMA、Calponin荧光强度增高,SOX2、OCT4荧光减弱。动物实验中,造模8周糖尿病大鼠ED综合成模率为57.14%;小动物活体成像和EdU示踪移植21 d内的ASCs仍存在于阴茎海绵体内,Myocd修饰的ASCs荧光强度较未修饰组高;Myocd修饰ASCs进一步提升了其改善阴茎组织形态、提高ΔICP/MAP及α-SMA、Calponin、Bcl-2蛋白表达水平,进一步降低了 Collagen Ⅰ、Bax 和 Cleaved-caspase3/caspase3;ASCs 移植后阴茎组织中 SDF-1蛋白含量增加。[结论]Myocd抑制ASCs增殖、增强细胞收缩力,促进ASCs在细胞功能和分子表达水平向平滑肌样细胞分化,其机制可能是通过激活SRF和抑制SOX2、OCT4实现的;小动物活体成像技术可更准确地进行移植ASCs的示踪,Myocd增强了ASCs的治疗效果,改善了阴茎组织形态,增加平滑肌含量,减少组织纤维化并抑制CCSM细胞凋亡,同时ASCs移植可能通过增加阴茎组织SDF-1招募和激活内源性干细胞修复受损的CCSM。


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