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2型糖尿病股骨骨折后骨硬化蛋白及WNT信号通路相关性研究

吴耀  
【摘要】:研究背景高血糖导致的骨折不愈合主要原因是在骨折修复的过程中,高血糖促进软骨细胞凋亡和破骨细胞分化,减少成骨和软骨内骨化。以往对骨钙素、1型胶原氨基端肽(PINP)和Ⅰ型胶原羧基端肽β特殊序列(β-CTX)的研究主要是针对于糖尿病骨质疏松的研究,尚未有骨硬化蛋白及上述指标在2型糖尿病(Type2DiabetesMellitus,T2DM)股骨骨折愈合中相关变化规律的报道。有发现,Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,及抑制成骨细胞凋亡方面起到积极的作用,但Wnt信号对于T2DM患者骨折修复是否发挥作用及其作用机制尚未见相关报道。研究目的1、股骨骨折合并T2DM患者相对于未合并T2DM患者在骨折愈合在急诊入院时血液骨代谢指标(骨硬化蛋白、骨钙素、PINP和β-CTX)的变化情况检测,通过对结果的分析比较,以确定候选主要参与骨折修复重建的关键因子。2、从细胞水平验证骨硬化蛋白对成骨细胞hFOB 1.19干扰后引起的成骨功能变化的规律,以确定骨硬化蛋白是否具有调节其余三个骨代谢标志物的作用。3、通过Wnt激动剂和骨硬化蛋白处理hFOB 1.19,来检测骨硬化蛋白是否通过调节Wnt信号通路上的β-连环蛋白(β-catenin)来调节骨重建的。4、沉默hFOB 1.19细胞β-catenin的表达,检测骨代谢指标骨钙素、PINP和β-CTX的变化规律,进一步揭示骨重建可能的调节机制,为研制治疗糖尿病导致的骨不愈合的药物提供新的药物治疗靶点。方法随机选取2014年6月到2015年6月在呼和浩特市第一医院骨科就诊的股骨骨折伴有T2DM患者32例作为实验组,同期在该时间段内股骨骨折未合并有糖尿病的患者27例作为对照组,全部患者在急诊入院时分别抽取静脉血液样本。采用酶联免疫吸附法(Elisa)测量骨折修复重建过程中骨钙素、PINP、β-CTX和骨硬化蛋白的含量变化。对hFOB 1.19细胞进行培养,骨硬化蛋白干扰hFOB 1.19细胞后,采用qRT-PCR检测骨钙素、PINP、β-CTX的mRNA表达量。Wnt激动剂和骨硬化蛋白处理hFOB 1.19细胞,采用免疫印迹(Western blot)法检测β-catenin和磷酸化β-catenin(p-β-catenin)含量变化。利用HiPerFect转染试剂盒转染 siRNA-β-catenin 到 hFOB 1.19 细胞中,Western blot 检测 β-catenin蛋白含量变化和qRT-PCR检测骨钙素、PINP、β-CTX的mRNA表达的变化。结果在股骨骨折急诊入院患者血清中,T2DM骨硬化蛋白的含量相对于对照组显著增高,骨钙素、PINP和β-CTX的含量显著降低,且骨硬化蛋白与骨钙素、PINP、β-CTX含量之间为线性负相关。骨硬化蛋白干扰hFOB 1.19细胞后,骨钙素、PINP和β-CTX的mRNA水平均随着骨硬化蛋白的浓度增高而逐渐降低,呈负相关。Wnt激活剂和骨硬化蛋白干扰hFOB 1.19细胞后,胞质中的β-catenin蛋白表达量无显著性差异,而Wnt激活剂可以下调细胞质中p-β-catenin的水平,骨硬化蛋白可以上调p-β-catenin的水平,而且骨硬化蛋白浓度越大p-β-catenin上调的水平越高。siRNA-β-catenin转染后成功干扰hFOB 1.19细胞β-catenin的表达,同时使骨钙素、PINP和β-CTX的mRNA水平显著降低。结论1、在股骨骨折早期愈合过程中,T2DM骨硬化蛋白的含量相对于对照组显著增高,骨钙素、PINP和β-CTX的含量显著降低,推测骨硬化蛋白可能参与T2DM骨折愈合过程。2、骨硬化蛋白可以下调骨钙素、PINP和β-CTX的mRNA表达水平,影响骨修复重建的进程。3、骨硬化蛋白可以上调p-β-catenin的水平,而且其浓度越大p-β-catenin上调的水平越高。推测骨硬化蛋白是通过调节p-β-catenin水平,进而参与调节骨折修复重建过程的。4、β-catenin表达的下降,可使骨钙素、PINP和β-CTX的mRNA水平显著降低,说明骨硬化蛋白是通过上调Wnt信号通路中β-catenin的磷酸化水平,来降低β-catenin表达,进而影响骨代谢标志物的表达水平。


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