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hHO-1联合GATA-4修饰大鼠骨髓间充质干细胞抗凋亡及向心肌分化的实验研究

邓宁波  
【摘要】:研究背景急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是当今社会严重威胁人们健康的临床常见危急重症之一。近年来研究表明,骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)移植在心肌细胞的修复和再生,心脏功能恢复等方面具有良好的发展潜力。然而移植的BMSCs在宿主的缺血缺氧微环境中生存率过低,向心肌细胞分化率低而限制了其疗效。细胞治疗和基因修饰相结合等技术的发展为受损心脏组织的修复及改善移植疗效提供了一种新的策略。血红素加氧酶-1(hHO-1)具有良好的抗氧化、抗凋亡作用。GATA-4是心脏细胞分化、发育过程中的重要转录因子,GATA-4可增强细胞旁分泌细胞保护因子并上调心肌细胞特异性基因的表达,促进BMSCs向心肌细胞分化。由于多方面因素可影响细胞移植的疗效,单基因修饰的BMSCs作用效果有限。而多基因联合可起到一定的治疗效果叠加,本研究通过hHO-1联合GATA-4修饰大鼠BMSCs,在体外模拟的缺血缺氧微环境下培养,探讨hHO-1联合GATA-4修饰的大鼠BMSCs抗凋亡能力及促进细胞向心肌细胞分化是否优于单独的hHO-1或GATA-4单基因修饰的大鼠BMSCs。目的探讨经人血红素加氧酶-1(hHO-1)基因和GATA-4基因联合修饰的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧环境中抗凋亡及体外分化为心肌细胞样细胞是否优于hHO-1、GATA-4单基因修饰的BMSCs。方法(1)采用全骨髓贴壁法提取,分离培养及纯化大鼠BMSCs。通过成脂、成骨诱导剂诱导大鼠BMSCs及流式细胞术检测大鼠BMSCs表面标志物对提取并纯化的大鼠BMSCs进行鉴定。(2)hHO-1、GATA-4 重组腺病毒转染 BMSCs;Western blotting 法确定基因表达的最佳时间。(3)以缺氧无血清条件模拟体内缺血缺氧微环境培养基因修饰的BMSCs;采用CCK-8法和台盼蓝染色法分别检测缺血缺氧培养12、24、48、72h细胞存活率;流式细胞术检测缺血缺氧培养24h细胞凋亡。(4)Western blotting法及细胞免疫荧光检测特异性心肌肌钙蛋白I(cTnI)。结果(1)经全骨髓贴壁法提取并纯化的细胞符合BMSCs的贴壁特性及镜下形态特征。流式细胞仪检测结果显示,第3代BMSCs的特异性表面标志物:CD29阳性,阳性率为98.0%;CD90阳性,阳性率为99.2%;CD45阴性,阳性率为0.5%。成脂诱导3周后,BMSCs有脂滴形成,油红O染色呈红色。成骨诱导3周后,BMSCs有钙结节形成,茜素红染色呈红色,证明所培养细胞为BMSCs。(2)Western blotting检测结果显示,hHO-1组目的蛋白的表达量随时间增加,在第4天达到最大;GATA-4组目的蛋白的表达量随时间增加,在第5天达到最大;而hHO-1+GATA-4组目的蛋白表达量的增加,在第4~5天达到最大。(3)台盼蓝染色法检测缺血缺氧培养12、24、48、72h的hHO-1+GATA-4组细胞生存率高于hHO-1组(P0.05)和GATA-4组(P0.05);CCK-8法检测缺血缺氧培养12、24、48、72h的hHO-1+GATA-4组细胞生存率高于hHO-1组(P<0.05)和GATA-4组(P0.05);流式细胞术检测缺血缺氧培养24h的hHO-1+GATA-4 组细胞凋亡低于 hHO-1 组(P0.05)和 GATA-4 组(P<0.05)。(4)Western blotting法检测cTnI结果显示,对照组没有cTnI的表达,GATA-4组与hHO-1+GATA-4组均有cTnI表达,但二者间表达差异无统计学意义;细胞免疫荧光法检测cTnI结果显示,对照组细胞没有cTnI表达,GATA-4组cTnI阳性细胞表达率为31.03%±1.91%,hHO-1+GATA-4组cTnI阳性细胞表达率为31.47%± 1.93%,二者之间阳性表达率差异无统计学意义。结论hHO-1与GATA-4联合可明显增强缺血缺氧BMSCs的存活;对比于GATA-4单基因修饰,联合修饰并没有增强BMSCs向心肌细胞分化。


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