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MiR-495-3p通过抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路中的Wnt抑制因子促进结肠癌细胞生长

林琳  
【摘要】:背景结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,它的发生率在一些西方国家呈下降趋势,主要是因为早期检查,早期预防和早期治疗。因此,识别结肠癌形成的潜在原因显得尤为重要。miR-495在多种肿瘤的发生、发展中起着重要的调节作用,被认为是肿瘤治疗的很有前途的靶点。miR-495通过靶向调节E-钙粘蛋白和REDD1促进乳腺癌细胞启动。同时观察到这种微小miRNA在MLL-重排的白血病中有减少。然而,我们对于miR-495,miR-495-3p的逆转链和它在结肠癌细胞的作用和表达知之甚少。目的本实验对miR-495-3p是促进结肠癌细胞形成的miRNA癌基因进行研究,并进一步探讨miR-495-3p是否通过抑制WIF1促进结肠癌细胞的多能性。本实验对miR-495-3p在结肠癌细胞生长的作用及其可能机制进行探讨,旨在为结肠癌的发病机制提供一个新的视角,发现结肠癌治疗的潜在新方向。方法用实时PCR检测细胞中miRNA和mRNA的水平,用MTT实验评估细胞活性。通过克隆试验判断细胞成球率,用蛋白印迹法检测蛋白表达,CHIP试验检测β-连环蛋白结合能力。利用荧光素酶试验检测miRNA目标基因。结果(1)MiR-495-3p在结肠癌细胞株及组织表达增高与正常结肠细胞株CCD18Co相比,miR-495-3p在六种结肠癌细胞株的表达水平明显升高(p0.05,)。miR-495-3p在结肠癌组织的表达明显高于配对的癌旁正常组织(p0.05)。(2)MiR-495-3p促进HCT-116细胞增殖和成球miR-495-3p或miR-495-3p-in的转染可调控MiR-495-3p的表达。此外,MTT实验证实经过四天的培养,miR-495-3p过表达上调HCT-116细胞活性而干扰miR-495-3p表达明显下调HCT-116细胞活性。同时,成球实验显示与对照组相比,miR-495-3p过表达显著的增加成球率而抑制miR-495-3p表达显著减少成球数量。这表明miR-495-3p可能影响HCT-116的增殖和成球。(3)MiR-495-3p促进Wnt信号通路HCT-116细胞株的TOP/FOP比率在miR-495-3p过表达后明显上升,而在miR-495-3p-in转染后明显下降(p0.05)。通过Western blot进行检测,我们发现在miR-495-3p组,细胞核里的β-连接蛋白含量明显升高(p0.05)。ChIP试验显示miR-495-3p过表达促进细胞核的β-连接蛋白与启动子MMP-9 and RUNX2结合,增强了基因转录和帮助结肠癌细胞增殖(p0.05)。(4)MiR-495-3p通过调控WIF1影响结肠癌细胞的生长荧光素酶检测证实miR-495-3p显著的减少WIF1 3'-UTR的荧光素酶活性然而它不影响WIF1 3'-UTR突变的荧光素酶活性。此外,WIF1缺失增强了被miR-495-3p-in转染而下调的HCT-116细胞株的成球能力。同时,WIF1水平与miR-495-3p负相关,更进一步证实miR-495-3p抑制WIF1 mRNA翻译成蛋白,从而促进Wnt信号通路活性。结论MiR-495-3p在结肠癌表达上调,这种致癌基因是Wnt/β-连接蛋白信号抑制因子的负调控器,其异常过表达增强Wnt/β-连接蛋白信号通路,促进细胞成球和多能性,从而导致结肠细胞增殖和形成肿瘤。这项研究为结肠癌的发病机制提供了一个新的视角,可成为结肠癌治疗的潜在方向。


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