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LncRNA-p3134在调控胰岛β细胞功能和胰岛素信号通路中的作用机制

阮玉婷  
【摘要】:研究背景胰岛是重要的内分泌器官,通过分泌胰岛素调节人体的糖代谢,维持血糖稳态。糖尿病高危的遗传背景加上外在的环境因素,最终将导致胰岛β细胞功能缺陷。因此深入探索糖尿病易感基因及表达改变情况,认识其发病机理,对糖尿病的早期诊断和个体化治疗具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,IncRNA)广泛参与机体几乎所有的生理和病理过程,在表观遗传水平、转录水平及转录后水平等多种层面上调控基因的表达。近年研究提出,1ncRNAs的异常表达与肿瘤、心血管疾病、感染、神经系统疾病以及糖尿病等复杂疾病的发生发展密切相关,具有促进或抑制疾病发生的作用。本研究主要探索IncRNA-p3134与胰岛β细胞糖代谢和胰岛素信号通路的相关性。目的筛选在2型糖尿病患者和正常人外周血中差异表达的IncRNA,探讨lncRNA-p3134对胰岛β细胞功能的影响及参与2型糖尿病发生发展的调控机制。方法(1)采用IncRNA基因芯片技术构建2型糖尿病患者外周血IncRNA的表达谱。采用RT-PCR检测lncRNA-p3134在30例2型糖尿病患者和30例正常对照人群中的表达水平,并分析IncRNA-p3134的表达与临床特征的相关性。分离提取两组人群血清外泌体RNA,进一步研究循环IncRNA的来源和表达模式;(2)采用慢病毒转染技术在Min6细胞过表达lncRNA-p3134,在不同糖浓度条件下观察IncRNA-p3134在胰岛细胞的表达水平。采用CCK-8法检测Min6细胞增殖活性,流式细胞技术和TUNEL染色观察细胞凋亡,并采用Western blot检测相关凋亡蛋白的表达水平。对Min6细胞进行葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(GSIS)并测定胰岛素释放水平,并采用PCR及Western blot检测胰岛素相关转录因子Pdx-1、MafA、GLUT2、TCF7L2的表达水平;(3)进一步观察高糖诱导的Min6细胞功能障碍能否通过lncRNA-p3134过表达逆转。在db/db糖尿病小鼠尾静脉转染lncRNA-p3134,行腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)并测定胰岛素释放水平及胰岛素相关转录因子的表达,利用免疫组化观察胰腺组织胰岛素阳性细胞比例。在细胞和动物水平采用Western blot检测胰岛素信号通路关键蛋白(PI3K、Akt、mTOR)的表达水平,并使用PI3K通路抑制剂(LY294002)观察lncRNA-p3134对PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控作用。结果与正常对照组相比,2型糖尿病患者外周血IncRNA-p3134的表达水平显著升高,并与空腹血糖水平呈显著正相关,与HOMA-p指数呈显著负相关(r=-0.412,p0.05)。循环外周血中差异表达的IncRNA-p3134主要分布于血清外泌体中,其表达水平较正常对照人群升高4倍,但在无外泌体的血清标本中,两组人群的表达水平未见显著差异。lncRNA-p3134的生物信息学分析提示其参与调控胰岛素信号通路和TCF7L2转录因子的调控。在Min6细胞中,lncRNA-p3134的表达水平受葡萄糖浓度的动态调控,适度的高糖上调lncRNA-p3134的表达,但在糖毒性条件下,表达受到抑制。InCRNA-p3134可通过上调胰岛素关键转录因子Pdx-1、MafA、GLUT2和Tcf712的表达,刺激胰岛β细胞合成和分泌胰岛素。其次,在Min6细胞过表达lncRNA-p3134可抑制胰岛细胞凋亡,并对高糖诱导的胰岛细胞功能障碍起保护作用。动物实验中,在db/db糖尿病小鼠体内过表达lncRNA-p3134可显著改善小鼠糖耐量水平,增加糖负荷前后的胰岛素释放。RT-PCR及Western blot发现lncRNA-p3134过表达组胰岛中的关键转录因子表达上调。免疫组化发现lncRNA-P3134增加胰腺组织胰岛素阳性细胞面积,进一步证实lncRNA-p3134对胰岛β细胞功能具有保护作用。通过进一步机制研究,发现lncRNA-p3134可上调胰岛素信号通路PI3K/Akt/mTOR的关键蛋白的表达。当给予PI3K通路抑制剂后,lncRNA-p3134促进胰岛素分泌的功能显著减弱。结论2型糖尿病特异表达的lncRNA-p3134,可能通过上调胰岛β细胞关键转录因子的表达,参与胰岛β细胞的功能保护,促进胰岛素的合成和分泌,延缓糖尿病的进展。这种保护作用可能与激活胰岛素信号通路PI3K/Akt/mTOR密切相关,为将来进一步明确胰岛β细胞功能的调控机制提供新的视角。


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