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秀丽隐杆线虫感染模型中不同耐药表型的肺炎克雷伯菌的毒力分析

彭黎  
【摘要】:1实验目的利用一种新的实验方法——固体培养法,建立秀丽隐杆线虫-肺炎克雷伯菌感染模型;利用该模型比较不同耐药表型的肺炎克雷伯菌致病能力的差异;分析其毒力机制并进一步探讨耐药性与毒力间的联系。2实验方法2.1线虫同期化处理将孕虫收集至离心管内,洗涤、离心,弃上清液,保留3.5mL液体;加入1.5mL线虫裂解液,剧烈震荡至虫体全部裂解;将收集的虫卵用M9缓冲液洗涤3次;20℃过夜培养,获得L1期线虫;将L1期线虫转移至NGM-OP50培养板,20℃培养48h至L4期。2.2感染平板的制备将复苏、培养后的待测菌液稀释至105cfu/mL,取10uL菌悬液滴加于SK琼脂平板上,涂布均匀;室温干燥后,37℃静置培养8h,冷却至室温备用。2.3线虫致死实验转接线虫前,在每块感染平板上滴加一定浓度的FUDR,抑制野生型线虫生长繁殖;每块感染平板上转接10条L4期线虫。以大肠埃希菌OP50喂养的线虫作为实验对照组。25 ℃培养,每24h观察一次线虫的活动状态,并记录线虫生存状态,当线虫无摇头、咀嚼等动作,并呈刚性直线时,判定为死亡。2.4不同耐药表型的肺炎克雷伯菌致病能力比较根据体外药敏结果,将实验组分为:敏感组、多重耐药组、碳青酶烯类耐药组。取不同耐药表型的肺炎克雷伯菌分别感染线虫(10条/皿),每株细菌至少准备3个样本。以大肠埃希菌OP50喂养的线虫作为对照组。25℃培养,每天记录线虫存活状态。2.5线虫体内细菌计数及鉴定在固定时间点,取肺炎克雷伯菌感染后的线虫;叠氮化钠清洗3次后,挑取5条线虫加入含有无菌的PBS溶液及石英砂的EP管内,震荡离心,使虫体裂解,释放细菌;取上清液进行细菌纯培养,并进行细菌菌种鉴定及药敏测试。2.6肺炎克雷伯菌毒力因子检测所有细菌进行拉丝实验,并采用PCR技术进行目标基因(包括荚膜血清型及毒力基因)检测。2.7统计分析以上实验均重复3次,采用IBM SPSS Statitics 19.0软件进行统计分析。Kaplan-Meier方法进行生存分析,Log-rank检验法对组间数据进行差异显著性分析。完全随机设计资料采用单因素方差分析进行均数比较。P0.05为差异明显。3结果3.1秀丽隐杆线虫-肺炎克雷伯菌感染模型建立结果显示,实验组较对照组,线虫致死现象明显。实验组与对照组线虫LT50(d)分别为 8.000±0.769,11.000±0.458,二者生存曲线存在差异(χ2=27.519,P0.05)。肺炎克雷伯菌感染24h、48h、72h后,线虫体内细菌数量分别为1.949×104cfu/mL、0.911×105cfu/mL、1.523×106cfu/mL,不同时间点感染线虫体内细菌数量有统计学差异(F=37.192,P0.001)。经LSD检验显示,各时间点间线虫体内细菌数量均有统计学差异(P0.05)。线虫体内细菌菌种鉴定及药敏结果与初始感染细菌一致。说明在实验时间范围内,肺炎克雷伯菌能在线虫体内定植、繁殖,并最终导致线虫死亡。3.2不同耐药表型肺炎克雷伯菌致病能力比较结果显示,对照组(大肠埃希菌OP50组)线虫LT50(d)为11.000±0.458,而敏感组、多重耐药组(MDRKP)、碳青霉烯类耐药组(CRKP)的LT50(d)分别为 10.000±0.231、9.000±0.080、9.000±0.130。三组致死时间(d)分别为 5.500、3.860、3.560,三组间致死时间具有统计学差异(F=5.610,P0.05),其中,敏感菌组与多重耐药组(MDRKP)、敏感组与碳青霉烯类耐药组(CRKP),致死时间均存在统计学差异(P0.05),多重耐药组与碳青霉烯类耐药组致死时间无统计学差异(P=0.498)。72h后,三组线虫体内细菌计数(106cfu/mL)分别为1.478±0.861、1.622±0.524、1.467±0.739,各组间无统计学差异(F=0.137,P=0.872)。3.3肺炎克雷伯菌毒力因子检测10株临床分离的肺炎克雷伯菌中,除敏感菌株KP3拉丝实验及rmpA基因检测阳性外,其余菌株拉丝试验及毒力基因检测均阴性。4结论4.1在国内首次采用利用一种新的实验方法——固体培养法,建立秀丽隐杆线虫-肺炎克雷伯菌感染模型。4.2耐药型菌株较敏感型菌株致病能力稍强,可在线虫体内长期定植、繁殖,导致秀丽隐杆线虫在更短的时间内死亡。4.3本实验检测范围内,耐药型菌株内并未发现导致毒力增强的相关毒力因子,提示可能存在其他机制导致毒力增强。


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