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MicroRNA-210调节Treg细胞在子痫前期免疫发病机制的研究

陈冀莹  
【摘要】:目的:我们的研究目的是评估子痫前期患者Treg细胞比率降低的调控机制,探讨子痫前期中microRNA-210(miR-210)基因表达水平,研究目的证实miR-210通过下调靶基因Foxp3来调节Treg细胞,进而揭示了miR-210在子痫前期中的调控机制。方法:采用酶联免疫吸附法检测子痫前期29例、正常孕妇27例及健康非妊娠妇女20例血清细胞因子(IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 1)的表达水平。采用流式细胞术分析外周血CD4+CD25+CD127low/-细胞。选择与上一组相同子痫前期29例、正常妊娠27例胎盘组织,提取总RNA,逆转录成cDNA,采用实时定量PCR方法,检测胎盘组织中Foxp3和RORc、miR-210的表达水平。蛋白质印迹法检测胎盘中Foxp3蛋白的表达。将具有miR-210结合位点的Foxp3 3'UTR序列(WT野生型,Mut人工突变型)克隆到psiCHECK-2荧光素报告质粒上,分组转染293T细胞,应用promega公司的双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性值,证明Foxp3是miR-210的直接靶基因。采用基因多态性分析方法,对203例子痫前期和243例正常孕妇确定基因型和等位基因变异。从静脉血DNA中提取Foxp3 SNPs 4个位点和TGF-β1 SNPs 3个基因位点进行分析。采用多重聚合酶链反应和连接酶检测反应对Fotxp3和TGF-β1基因进行基因分型。结果:①子痫前期患者血清IL-6、IL-17和TGF-β 1浓度较正常孕妇明显升高(IL-6,P=0.0021;IL-17,P=00.015;TGF-β1,P=0.019),Treg细胞因子IL-10水平低于正常孕妇(IL-10,P=0.0012),差异有显著性(P0.05)。②子痫前期患者外周血CD4+CD25+CD127-/CD4+T细胞百分率明显低于正常妊娠组(6.34±0.28%vs.9.10±0.28%,P0.001),低于健康非妊娠妇女(6.34±0.28%vs.8.74±0.54%,P0.001)。③ 子痫前期患者胎盘组织中表现为Foxp3 mRNA水平明显低于正常孕妇(0.713±0.088 vs.1.105±0.136,P=0.019)。子痫前期患者的RORc mRNA水平明显高于正常孕妇(0.599±0.069 vs.0.380±0.046,P=0.0127),提示子痫前期患者存在Treg/Th17失衡。④miRNA-210在子痫前期患者组的表达增强(1.744±0.153 vs.0.578±0.744,P0.001)。子痫前期患者胎盘组织Foxp3蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。⑤生物信息学方法预测Foxp3是miR-210可能的靶基因。⑥本实验构建了包含Foxp3基因3'-UTR miR-210结合位点的报告基因表达载体。荧光素酶报告基因系统检测结果表明:与psiCHECK-2-REP0RT-Foxp3WT与miR-210 mimic及阴性对照组共转染组相比,psiCHECK-2-REP0RT-Foxp3WT中荧光素报告基因表达显著降低,而psiCHECK-2-REP0RT-Foxp3Mut与miR-210 mimic转染组及阴性对照转染组均无此作用。进一步证明Foxp3是miR-210作用靶基因。⑦过表达miR-210对调节性T细胞转录因子Foxp3表达的影响与对照组比较,转染miR-210 mimic组的CD4+T细胞中,Westernblot检测Foxp3蛋白水平均明显降低,灰度值的半定量分析结果具有显著差异。差异有统计学意义(p0.05)。⑧子痫前期患者TGF-β1 rs1800478 TT基因型频率高于正常妊娠对照组[CC vs.CT+TT:odds ratio(OR)=1.71,95%CI,1.04-2.81;P=0.033],表明rs1800469的T等位基因有发生PE的危险[OR=1.46;95%CI,1.12-1.92;P=0.006]。结论:我们的数据表明子痫前期患者存在Treg细胞数量减少,这些变化破坏母体对胎儿的免疫耐受。在子痫前期患者胎盘组织中Foxp3表达水平明显降低,与miR-210的表达水平呈显著负相关。本实验构建了包含Foxp3基因3'-UTR miR-210结合位点的报告基因表达载体。通过体外荧光素酶报告系统验证了Foxp3是miR-210的靶基因。我们提出子痫前期发病机制之一可能为:miR-210表达增强抑制Foxp3蛋白表达,进而导致Treg细胞功能降低,Treg细胞分泌细胞因子表达水平异常,引起子痫前期免疫系统调节功能紊乱。未来研究miR-210作为子痫前期早期诊断生物标志物,具有重要应用前景。本研究进一步证实Foxp3和TGF-β1基因多态性与子痫前期的关系。提示TGF-β1 rs1800469 T等位基因变异对中国汉族妇女发生PE的风险增加,携带rs1800469 TT基因型的中国孕妇发生PE的风险增加。


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