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基于斑马鱼炎症模型筛选的中药活性成分药理效应与作用机制研究

谢佩  
【摘要】:背景与目的斑马鱼模型因其简单经济、与人类基因组和人类疾病相关基因高度同源等优势,近年来在人类疾病研究中发挥重要作用。急性肺损伤(ALI)能够诱发全身失控性炎症反应,发生率和死亡率高,目前仍无有效的治疗方法。本文利用斑马鱼炎症模型评价了大黄素和3-脱水穿心莲内酯(3-DA)的抗炎活性,并探索了这两个化合物的抗ALI机制。方法与结果1.大黄素和3-DA可提高炎症斑马鱼的生存能力,并抑制硫酸铜、尾部横切或卵黄囊注射LPS导致的炎症斑马鱼中性粒细胞的迁移。2.MTT法确定大黄素在RAW264.7细胞上的非毒剂量。ELISA结果表明大黄素剂量依赖性地降低tumor necrosis factor-α(TNF-α)和interleukin-6(IL-6)的水平。Western blotting检测显示大黄素抑制JNK(Thr183/Tyr185)的磷酸化,但对p38(Thr180/Tyr182)和ERK(Thr202/Tyr204)的磷酸化无明显影响。大黄素还可上调Nur77的表达,抑制Nur77(Ser351)的磷酸化,抑制c-Jun的表达及其磷酸化(Ser73)。SP600125(JNK特异性抑制剂)与大黄素协同调控Nur77/c-Jun信号通路,而茴香霉素(JNK特异性激活剂)拮抗大黄素对Nur77/c-Jun信号通路的调控作用。双荧光素酶报告基因实验显示大黄素通过JNK上调Nur77的启动子活性。siRNA转染和EMSA表明大黄素通过上调Nur77抑制c-Jun的表达、磷酸化以及DNA结合活性。建立LPS气管滴注诱导的BALB/c小鼠ALI模型。HE染色表明大黄素可减轻肺组织病理学改变。肺干湿重比(W/D)说明大黄素降低肺水容量。BCA法检测提示大黄素降低BALF中总蛋白渗漏。ELISA检测发现大黄素降低肺部灌洗液(BALF)中TNF-α和IL-6的表达。Western blotting检测说明大黄素能够调控Nur77/c-Jun通路。而茴香霉素拮抗大黄素对ALI的以上保护作用。表面等离子共振(SPR)和HPLC-MS/MS检测到大黄素捕捉细胞中106个可能性靶蛋白。Western blotting检测发现大黄素降低LPS诱导的RAW264.7细胞和ALI小鼠中ROCK1表达、上调PAK2的磷酸化。3.MTT法确定3-DA在RAW264.7细胞上的非毒剂量。ELISA方法检测发现3-DA剂量依赖性地降低TNF-α和IL-6的水平。Western blotting结果表明3-DA抑制IκBα的降解和磷酸化(Ser32)。Western blotting和共聚焦显微镜观察发现3-DA抑制NF-κB p65 的入核。Western blotting表明大黄素抑制Akt(Ser473)的磷酸化,上调α7nAchR的表达。SPR发现3-DA可与α7nAchR直接结合。Western blotting表明α7nAchR siRNA和MLA(一种α7nAchR特异性抑制剂)能够拮抗3-DA对NF-KB/Akt信号通路的抑制作用。3-DA可减轻肺组织病理学改变,降低肺中总蛋白渗漏,降低肺水容量和TNF-α、IL-6表达,抑制NF-κB/Akt信号通路,而MLA能够拮抗3-DA对ALI的保护作用。结论本研究明确了大黄素和3-DA具有抑制LPS诱导的ALI的作用。并首次发现:①大黄素通过调控JNK/Nur77/c-Jun信号通路抑制炎症反应;②3-DA通过激活胆碱能抗炎通路抑制炎症反应。


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