阿司匹林抗结直肠癌作用靶点的生物信息学分析及机制研究

【摘要】：研究背景结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是常见的恶性肿瘤,发病率在全球恶性肿瘤中位居第3位,死亡率位居第2位。阿司匹林是目前最具前景的CRC化学预防药物之一。虽然阿司匹林在预防CRC方面的作用得到了肯定,但具体的分子机制尚未达成共识。生物信息学分析具有高效、经济、灵活等优势。药物数据库及多种公共基因表达谱数据库为我们预测与疾病相关的关键基因、作用通路,寻找潜在的生物标志物及药物作用新靶点提供了广泛的平台。研究目的本文旨在基于生物信息学方法,通过药物数据库和多种公共基因表达谱数据库预测并分析阿司匹林防治CRC的潜在作用靶点,并进一步通过实验研究阿司匹林对人结肠癌细胞株HT-29的生物学功能及对潜在作用靶点的影响,探讨阿司匹林抗CRC可能的作用机制。研究方法1、阿司匹林作用靶点的确定:在DrugBank 5.1.7中查找阿司匹林的直接作用蛋白靶点(Direct protein targets,DPTs),构建阿司匹林DPTs的蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction,PPI)网络并分析相关信号通路。2、CRC相关差异表达基因的筛选:从基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中获取4个CRC表达谱芯片数据,分析CRC组织与正常组织中差异表达的基因。筛选出节点度最高的20个CRC相关差异表达基因作为Hub基因(枢纽基因)。3、阿司匹林抗CRC的潜在作用靶点的预测及分析:将DPTs相关联的基因与CRC的Hub基因求交集以预测阿司匹林抗CRC的潜在作用靶点,分析其在癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中结肠腺癌样本的表达情况并对这些潜在作用靶点进行GO分析和KEGG信号通路分析。4、阿司匹林对结肠癌细胞生物学功能的影响:通过CCK8实验、免疫荧光实验、划痕实验、Transwell侵袭实验和流式细胞术检测不同浓度阿司匹林干预HT-29细胞后对细胞活性、迁移能力、侵袭能力、细胞周期和细胞调亡的影响。5、阿司匹林对作用靶点表达水平的影响:反转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western bolt,WB)实验验证阿司匹林对所预测的潜在作用靶点mRNA、蛋白表达水平的影响。研究结果1、在DrugBank 5.1.7中确定了 11个阿司匹林DPTs,KEGG信号通路分析发现其中 6 个 DPTs(EDNRA、IKBKB、NFKB2、NFKBIA、PTGS2 和 TP53)富集在与癌症相关的信号通路上。将DPTs相关联的基因与筛选的20个CRC的Hub基因求交集,发现5个基因(CDK1、AURKA、CCNB1、MAD2L1和TPX2)可能是阿司匹林抗CRC的潜在作用靶点。2、CDK1、AURKA、CCNB1、MAD2L1 和 TPX2 在 TCGA 数据库结肠腺癌样本中均表达上调,基因功能主要富集于细胞周期时相转换的调控、微管的组成等生物学过程。3、CCK8实验、免疫荧光实验结果显示随着阿司匹林浓度的增高,HT-29的细胞活性显著降低,增殖能力显著下降。划痕实验结果显示随着阿司匹林浓度的增高,HT-29细胞的迁移能力显著降低。Transwell侵袭实验结果显示随着阿司匹林浓度的增高,HT-29细胞的侵袭能力显著降低。流式细胞术检测结果显示阿司匹林可使HT-29细胞阻滞于G0/G1期,且随着阿司匹林浓度的增加,HT-29细胞的凋亡率显著增高。4、RT-PCR和WB实验结果显示阿司匹林可以显著降低HT-29细胞中的CDK1、AURKA、CCNB1、MAD2L1 和 TPX2 的 mRNA水平和蛋白表达水平。研究结论阿司匹林能够显著抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,诱导细胞阻滞于G0/G1期及促进细胞凋亡。CDK1、AURKA、CCNB1、MAD2L1和TPX2可能是阿司匹林抗CRC的潜在作用靶点。