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农杆菌介导龙胆花色素苷5-O-葡糖基转移酶基因的番茄遗传转化体系的建立及优化

孙靖棣  
【摘要】:番茄(Lycopersicon esculentum Mill)系茄科(Solanaceae)番茄属(Lycopersicon)一年生或多年生草本双子叶植物,具有富含多种营养成分,较为容易成活,培育时间较短,基因组DNA组成较清楚,遗传转化较容易等优点。番茄作为植物遗传转化研究中的模式植物,其研究结果不仅具有重要的理论意义而且具有重要的应用价值。 本研究以质粒pCAMBIA1304为载体,龙胆UDP-葡萄糖:花色素苷5-O-葡糖基转移酶(Gt5GT7)基因为目的基因,构建植物表达载体。以发根农杆菌菌株A4为介导系统,将Gt5GT7基因导入10种基因型番茄植株,旨在建立高频番茄遗传转化系统。 主要研究结果如下: 1、根据GenBank公布的Gt5GT7基因(AB363839)序列设计引物,并分别在两端增加BglII和BstEII酶切位点,进行pcr4topo-Gt5GT7质粒的PCR扩增反应,通过试剂盒回收纯化提取Gt5GT7基因。再用限制性内切酶BglII和BstEII对通过PCR扩增获得的Gt5GT7目的基因和pCAMBIA1304质粒进行双酶切。回收BglII和BstEII双酶切得到目的基因Gt5GT7和pCAMBIA1304质粒大片段,然后用Takara连接试剂盒连接Gt5GT7基因和pCAMBIA1304质粒大片段,再将连接体系转化大肠杆菌菌株DH5α。提取抗性菌落的质粒,用BglII和BstEII对质粒进行双酶切检测,结果表明,植物表达载体pCAMBIA1304-Gt5GT7构建成功。 2、采用电转化法,将构建成功的植物表达载体pCAMBIA1304-Gt5GT7导入到发根农杆菌菌株A4中。利用重组的发根农杆菌菌株A4为介导系统,采用叶盘法,将植物表达载体pCAMBIA1304-Gt5GT7导入番茄,以建立高频番茄遗传转化再生体系。 3、本研究通过大量实验筛选得出:最佳愈伤组织诱导培养基为:MSB5+6-BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L-0.5mg/L;最佳不定芽诱导培养基为: MSB5+6-BA2.0mg/L+IAA0.15mg/L-0.5mg/L;最佳生根诱导培养基为:1/2MS+IBA0.5mg/L。 4、以本研究中构建的植物表达载体pCAMBIA1304-Gt5GT7为阳性对照,以野生型番茄植株基因组为阴性对照,对通过遗传转化得到转Gt5GT7基因再生植株基因组DNA进行PCR扩增反应,进行检测。检测结果表明:有再生植株扩增出大小为1892bp的目标条带,与阳性对照扩增出的条带位置相同,阴性对照无目标条带,初步说明目的基因Gt5GT7已整合到番茄基因组DNA中。 5、在转Gt5GT7基因的番茄再生植株中,表现型出现变化:未转化番茄(贼不偷)成熟果实为绿色,转基因番茄(贼不偷)再生植株成熟果实为淡橘色。


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