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固定化酶微反应器和混合基体应用于MALDI TOF-MS的肽谱分析和小分子分析

郭忠  
【摘要】: 以各种软电离技术为手段的生物质谱的兴起标志着质谱学从近代结构和分析化学领域进入生命科学范畴。基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)作为生物质谱最主要的组成部分之一,由于其分析速度快、灵敏度高、适合于复杂体系分析及抗杂质干扰能力强的特点,成为当前质谱领域中的研究热点。 本论文利用熔融石英毛细管为载体,制备了共价键合及金属螯合两种蛋白质水解酶固定化微反应器。利用微反应器水解蛋白样品、质谱检测水解产物然后将所获得的肽质谱图用于蛋白质数据库检索,从而建立了微量蛋白质的快速结构分析和鉴定方法。实验表明这种方法可以对低达9 fmol的蛋白质进行鉴定。 针对常规光谱法测定酶微量反应困难的问题,采用MALDI TOF-MS质谱方法来表征固定化毛细管微反应器酶的活性。以精氨酸及N_α-苯甲氧羰基-L-精氨酸为内标物首先考察了MALDI质谱定量分析能力,同时通过对质谱法和常规分光光度法测定胰蛋白酶活性的比较,验证了质谱方法的可行性。进而对固定化酶的最适反应pH值、温度、稳定性等性质进行考察,并测定出其反应动力学常数K_m。 针对MALDI分析小分子时常规有机基体信号干扰问题,提出利用在常规基体中加入表面活性剂以抑制基体信号的新方法,成功地进行了低分子量化合物的分析。考察了表面活性剂与基体浓度的比例对质谱分析结果的影响,并对离子化机理进行推测,同时应用这种方法对氨基酸、多肽和药物等小分子进行了分析。此外还考察了该方法定量分析的可行性。


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