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三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)丝氨酸蛋白酶及其同源物的基因克隆和表达分析

李倩倩  
【摘要】:三疣梭子蟹(十足目:短尾次目:梭子蟹属)是我国重要的海水养殖品种,但随着养殖规模的不断扩大以及养殖集约化程度的不断提高,由细菌、真菌和病毒等引起的各种病害日趋严重,给三疣梭子蟹养殖业造成巨大损失。深入开展三疣梭子蟹免疫防御机制相关研究,探索免疫防治新途径,是实现其健康养殖的可靠保障。无脊椎动物中普遍存在的丝氨酸蛋白酶及其同源物参与了个体的先天免疫,包括血淋巴凝集,抗菌肽合成,细胞吸附和黑化反应等,这为我们研究三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶及其同源物在抵御外界微生物过程中的作用提供了重要依据。 本研究在实验室构建的三疣梭子蟹血细胞和眼柄全长cDNA文库基础上,依据测序得到的EST序列进行序列拼接、发现并确定了6条丝氨酸蛋白酶及其同源物cDNA全长序列,并采用基因克隆、实时定量PCR、重组蛋白原核表达等分子生物学技术开展了对这些基因的结构、组织分布、不同类型微生物感染下的表达规律、部分基因的基因组序列及其原核重组蛋白的表达情况进行研究,进一步探讨它们在三疣梭子蟹免疫防御中的作用。 三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶氨基酸序列中均包含Tryp_SPc结构域。根据其氨基酸序列中N端是否有Clip结构域分成两组,一组是无Clip结构域的丝氨酸蛋白酶(PtSP)和丝氨酸蛋白酶同源物(PtSPH1),另一组是有Clip结构域的丝氨酸蛋白酶(PtcSP1-3)和丝氨酸蛋白酶同源物(PtcSPH)。丝氨酸蛋白酶同源物在序列上与丝氨酸蛋白酶类似,但催化三联体中的一个或多个保守残基发生突变,与多数丝氨酸蛋白酶一样,PtSPH1第三个活性位点丝氨酸(Ser)被甘氨酸(Gly)取代,PtcSPH则较为特殊,其第二个活性位点天冬氨酸(Asp)被丙氨酸(Ala)取代。 PtSP的cDNA序列全长为1266bp编码286个氨基酸,PtSPH1的cDNA全长为1507bp共编码411个氨基酸。PtcSP1、PtcSP2、PtcSP3和PtcSPH的cDNA序列全长分别为1513,1363,1461和1530bp,分别编码382、400、415和379个氨基酸。另外,本研究中还克隆得到PtSP、PtSPH1基因组序列,PtSP的基因组有7个外显子和6个内含子,并发现在第一个外显子与内含子之间存在一个非正常剪接位点(GG-AG);PtSPH1的基因组有5个外显子和4个内含子,PtSP、PtSPH1基因组中其它外显子内含子剪接位点均符合GT-AG规则。 为进一步分析丝氨酸蛋白酶及其同源物在先天免疫中所起到的作用,利用实时定量PCR的方法分析这些基因在健康三疣梭子蟹各个组织中的分布与不同类型微生物感染下的表达规律。组织分布结果表明,这些基因在血液、眼柄、鳃、胃、肝胰腺、心脏中均有表达,但呈不同的表达模式。PtSP mRNA主要在血细胞、鳃、眼柄中表达,而PtSPH1mRNA主要在胃中表达。PtcSP1-3和PtcSPH同样在各个组织中呈现出不同的分布模式,PtcSP1、PtcSP2均在在鳃和眼柄中表达量较高,而PtcSP3和PtcSPH在血细胞中表达量最高,提示各个基因在免疫中发挥的重要作用。 在三疣梭子蟹后受到溶藻弧菌、藤黄微球菌、毕赤酵母菌刺激后,PtSP在藤黄微球菌刺激后,其表达量仅在刺激后第8小时出现一个较为明显的峰值,在其它时间段表达量相对于对照组有较为轻微的上升;PtSPH1表达量在三种菌后的48小时内均表现出明显的上升,表明PtSPH1对于菌液刺激更为敏感。有Clip结构域的丝氨酸蛋白酶及其同源物中,在三种菌刺激后,PtcSP1-3的表达量均表现出明显上升,表明这三个有Clip结构域的丝氨酸蛋白酶均参与到三疣梭子蟹抵御革兰氏阴性菌、革兰氏阴性菌、真菌的免疫反应中;相对于其它两种菌来说,溶藻弧菌刺激后PtcSPH表达量变化最为明显,这些发现均表明有Clip结构域的丝氨酸蛋白酶及其同源物在抗菌免疫反应中各自发挥不同的作用。


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