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水母毒素的分离纯化及蛋白质组学研究

李荣锋  
【摘要】:水母(Jellyfish)分布广、种类多、资源丰富。水母毒素主要分布于触手的刺丝囊细胞中,是一类结构新颖且具有多种生物活性的蛋白。但是,由于水母种类的不同,其毒素的结构、生物活性也存在一定的差异。本论文以近年来经常在我国近海区域大规模出现的霞水母(Cyanea sp.)和沙蜇(Stomolophus meleagris)为研究对象,研究水母毒素的提取制备方法、生物活性、分离纯化及其蛋白质组学分析等,主要结果如下: 1.对水母毒素的提取制备方法进行了研究。以霞水母为研究对象,首先制备水母的刺丝囊细胞,然后采用组织研磨器Mini-beadbeater破碎刺丝囊细胞提取毒素,并且研究了提取过程中蛋白酶抑制剂对霞水母毒素溶血活性的影响,结果发现1mmol/LEDTA和4μg/mL PepstantinA能够有效地保护霞水母毒素的溶血活性。 2.研究了水母毒素的溶血活性,并经纯化得到具有溶血活性的蛋白。霞水母和沙蜇毒素对鸡血红细胞均具有明显的溶血活性,其半溶血率HU50分别为10和10.5μg/mL;理化因素对溶血活性的影响中,温度的影响最敏感,在37℃时溶血活性最强,但是当温度超过45℃时,其溶血活性明显降低。采用离子交换层析(DEAE Sepharose Fast Flow)和凝胶过滤层析(Superdex75/200)等分离纯化方法,分别从霞水母和沙蜇毒素中分离到具有溶血活性蛋白CnPH和SmTX,其对鸡血红细胞的半溶血率HU50分别为5和70μg/mL。 3.研究了水母毒素的体外抗氧化活性,并对沙蜇毒素的抗氧化活性蛋白进行分离纯化。结果表明,霞水母和沙蜇毒素对羟自由基(·OH)的半清除率EC50分别为200和500μg/mL,对超氧阴离子(O2-·)的半清除率EC50分别约为5.5和75μg/mL。利用硫酸铵分级沉淀和凝胶过滤(Superdex75)两种分离方法,从沙蜇毒素中分离到分子量为90kDa具有抗氧化活性的蛋白SmP90,该蛋白具有明显的清除超氧阴离子自由基(O2-·)的能力,其半清除率EC50约为16μg/mL,并且测定其N末端序列为:Asn-Leu-Asp-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Tyr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Gly-Gly。 4.以沙蜇毒素蛋白为载体,利用Shotgun蛋白质组学方法首次对水母毒素的蛋白组成进行分析,共鉴定出181种蛋白。利用生物信息学方法将鉴定出来的蛋白质进行信息学分析,包括按照生物学进程、细胞组分及分子功能将其分别分为13、9和7类;并且从生物学通路里映射到33条相应的通路,在此基础上构建了基因网络来分析这些蛋白质可能存在的酶-酶、蛋白-蛋白以及基因表达之间的相互关系。 通过本文的研究表明:霞水母和沙蜇毒素具有明显溶血活性和抗氧化活性,经过分离纯化,分别从霞水母和沙蜇毒素内分离到溶血活性蛋白CnPH和SmTX及抗氧化活性蛋白SmP90;并应用蛋白质组学方法分析了沙蜇刺丝囊细胞毒素蛋白,共鉴定出181种蛋白质并且利用生物信息学方法对其进行了统计分析。


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