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海湾扇贝Myostatin研究及其单核苷酸多态性分析

郭琳  
【摘要】:Myostatin(MSTN),肌肉生长抑制素,又名GDF-8,是转化生长因子β超家族的成员,是近年来发现的一类重要的肌细胞生长的负向调控因子。将其去除可引起肌细胞的增生和肥大,肌肉质量的增加。畜牧业中的优良品系——双肌牛,如比利时蓝牛和皮埃蒙特牛,即是该基因突变的结果。由此可见,该基因在畜牧业和水产养殖业中具有重大的潜在应用价值。 本研究以本实验室育成的“中科红”海湾扇贝为实验材料,通过Genome walking等技术,共获得了12473bp的基因序列,包含基因组序列和上游调控元件,并对其进行了相关的分析。发现,海湾扇贝的MSTN基因是由三个外显子和两个内含子组成。这与其他物种中得到的结果一致。其内含子1长度为3991bp,内含子2长度为2064bp。开放阅读框的分析结果却发现,该基因的开放阅读框1380bp,编码459个氨基酸,比之前文献报道多77个氨基酸,并含有一个19个氨基酸的信号肽。 为了确认这一结果,又通过RACE的方法,获得了该基因的cDNA全长,将此基因命名为Ai-MSTN。序列分析得知,其5'-UTR以及上游调控区含有顺式作用元件和11个E-box(肌肉相关的调控元件)。在3'-UTR区域,本研究发现在poly (A)上游18nt存在一个加尾信号ATTAAA。 通过序列比对和构建进化树,结果发现,Ai-MSTN与栉孔扇贝的MSTN相似度最高,为85.8%,并且聚为一类,同时发现C末端的相似性较高。采用软件进行了成熟肽区域三级结构的3D模拟,结果表明,海湾扇贝的MSTN蛋白单体与小鼠的MSTN蛋白单体在三维结构上较为一致,然而海湾扇贝含有一个较小鼠长8个氨基酸的α-螺旋区域。 对Ai-MSTN进行了时空表达的研究。结果表明,海湾扇贝的MSTN基因在闭壳肌、肝胰腺、围心腔、鳃、外套膜、性腺中均有表达,在闭壳肌中的表达量最高,不仅如此,在血淋巴中也检测到有所表达,这也是目前为止,首次在软体动物的血淋巴中发现有MSTN基因的表达。进一步研究表明,在不同的胚胎和幼虫发育时期,MSTN的转录本均检测到表达,甚至包括未受精的卵中亦有表达,因此,推测MSTN在海湾扇贝中存在广泛的时空表达。 鉴于该基因与其他物种的相似性以及含有肌肉相关的调控元件,亦进行了SNP的检测及与生长性状包括闭壳肌重的关联分析。通过对3个外显子区域以及部分上游调控区共计1167bp的测序结果,发现2个SNP位点,其中一个位于上游调控区,发生了AT突变,另外一个在外显子2,发生了TG突变,没有改变氨基酸。在这两个位点分别设计引物,采用FLDAS-PCR和AS-PCR方法,检测了中科红几个养殖群体和一些野生海湾扇贝个体的基因型分布情况,并进行了SNP和生长性状的关联分析,结果发现外显子2处的SNP,在一个养殖大群(1年)中,TT基因型的个体,其全湿重、闭壳肌重、壳长和壳高数值较大,与SNP的基因型存在统计学的相关性。 总之,本研究对之前有关海湾扇贝MSTN基因的研究进行了补充和扩展,并且阐明了多项该基因在海湾扇贝中与在哺乳动物中的不同点,发现了一个与选育的中科红品种生长性状存在相关性的SNP位点。这使我们对海湾扇贝的MSTN有了进一步的认识,为进一步发掘该基因的功能奠定了基础。


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