中华绒螯蟹免疫致敏现象及相关分子机制的初步研究

【摘要】：免疫致敏在无脊椎动物抵御外界病原重复感染中发挥着重要的作用，也为无脊椎动物的病害防治提供了一定的参考。目前在很多种无脊椎动物中都发现了免疫致敏现象，但免疫致敏相关的机制研究却十分有限。本研究采用免疫学方法检测了细菌重复刺激前后中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)死亡率及细胞和体液免疫指标的变化；采用RACE、RT-PCR和原核重组表达等分子生物学技术对中华绒螯蟹Dscam (Down syndrome cell adhesion molecule)、Peroxinectin和Masquerade三种黏附分子进行了克隆表达及功能研究，并初步探讨了其在免疫致敏过程中的可能作用。 经过灭活的嗜水气单胞菌免疫的中华绒螯蟹在免疫后7d再次接受活的嗜水气单胞菌刺激时的存活率显著高于未免疫组、藤黄微球菌免疫组和生理盐水对照组。灭活嗜水气单胞菌免疫组中华绒螯蟹的血细胞吞噬作用显著高于藤黄微球菌免疫组，且相比嗜水气单胞菌初次免疫时显著升高并能维持较长时间，吞噬指数也显著增加。经嗜水气单胞菌免疫的血清对同种菌的抗菌能力要强于对不同种菌的抗菌力，具有一定程度的特异性，而藤黄微球菌免疫组的血清对嗜水气单胞菌无明显的抗菌能力。嗜水气单胞菌免疫后的血清PO活性升高的趋势较藤黄微球菌组明显，而溶菌酶活性在两次处理前后并无明显差异。 中华绒螯蟹Dscam基因和Masquerade基因的cDNA全长分别为5125bp和1525bp。Dscam基因的编码蛋白包含10个Ig功能域和6个FN3结构域，在Ig2，Ig3和Ig7区域检测到多种可变剪接体。Masquerade基因的编码蛋白含有trypsin-like丝氨酸蛋白酶功能区。Dscam基因、Peroxinectin基因和Masquerade基因在各组织中均呈组成型表达，分别在心脏、血细胞和肝胰脏、血细胞中表达量最高。Dscam蛋白和Peroxinectin蛋白主要定位于血清及细胞膜上。检测三个基因的mRNA在中华绒螯蟹接受不同菌刺激后的表达水平发现，Dscam基因和Peroxinectin基因对酵母菌刺激的反应较强烈，而Masquerade基因对鳗弧菌的刺激有明显的响应。在遭受嗜水气单胞菌第二次刺激后，Dscam基因mRNA的表达水平与初次免疫时相比显著升高；而Peroxinectin和Masquerade基因表达量均在嗜水气单胞菌初次免疫后升高，再次刺激后前者显著下降后者则无显著变化。截取保守区域共2.57kb进行体外原核重组表达，发现体外重组Dscam蛋白具有促包囊化作用。Peroxinectin和Masquerade重组蛋白均具有促吞噬、促包囊化活性，Masquerade重组蛋白还具有抗大肠杆菌活性。 综上所述，中华绒螯蟹在接受相同菌重复刺激时免疫功能增强，且这种增强的免疫保护作用具有一定的特异性，说明中华绒螯蟹中存在免疫致敏现象。黏附分子Dscam，Peroxinectin和Masquerade均参与了中华绒螯蟹对病原的免疫防御反应，并可能以不同的方式参与中华绒螯蟹的免疫致敏。该结果丰富和发展了无脊椎动物免疫致敏现象的研究，并为进一步揭示免疫致敏的分子机制奠定了基础。