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基于高通量测序的刺参白化发生和子代体色分离研究

马得友  
【摘要】:体色变异大是仿刺参的特征之一,黄褐色是最常见的体色,而通体白色的刺参则十分罕见,被誉为参中“极品”,培育优良的白刺参品系必然有广阔的市场前景。在白刺参人工繁育过程中子代出现体色分离和生长存活差异的现象。刺参基因组序列的缺乏导致关于刺参白化发生机理和白参体色分离子代基因表达差异的研究报道较少。本文借助高通量测序技术,研究刺参白化发生的机制和白参子代的基因表达差异,为白刺参的遗传育种提供科学依据,为培育优良的白刺参品系提供理论支持。主要研究结果如下: 1.在白刺参和青刺参体壁和肠道构建的转录组库中,分别利用454测序平台得到27357个和57119个Unigene,被注释的分别有6539个和5822个,通过GO注释的分别有3983个和2918个。6162个Unigene匹配到15个物种,其中匹配到紫海胆和仿刺参的数量最多。GO分析发现白刺参和青刺参在“色素沉积”、“繁育”、“细胞组分生物合成”方面差异较大。黑色素合成信号通路分析发现在白刺参中参与酪氨酸代谢的HGO基因显著上调,使黑色素合成底物酪氨酸减少,从而使黑色素的合成减少。而与黑色素合成相偶联的MAPK信号通路、Wnt信号通路、Jak-STAT信号通路以及黑色素合成过程中都有显著下调的基因,如Ras基因、PKA基因、PKC基因等,这些基因表达受到抑制,使黑色素合成的信号传递过程在白刺参中传递受阻,从而使黑色素的合成减少。 2.与对照青刺参相比,在白色幼参体壁中有476个上调基因和362个下调基因,其中表达量改变5倍以上有71个的(上调22个,下调49个)。上调5倍以上的注释基因有9个,主要参与免疫防御;下调5倍以上的注释基因有21个,主要参与生长发育和代谢过程。与对照青刺参相比,在体色分离幼参体壁中有362个上调基因和222个下调基因,其中52个基因的表达量改变5倍以上(上调23个,下调29个)。上调5倍以上的注释基因有12个,主要参与免疫防御;下调5倍以上的注释基因有16个,主要参与信号转导和生长发育。RT-PCR验证的差异基因表达趋势与RNA-Seq结果一致。信号通路富集分析发现在白色幼参中显著富集上调基因的信号通路有6条(Q value 0.05),分别参与吞噬作用、免疫应答、病理反应及凋亡;而显著富集下调基因的信号通路有1条,参与细胞因子的相互作用。而在体色分离幼参中显著富集上调基因的信号通路有2条(Q value0.05),分别参与吞噬作用和抗原感染;显著富集下调基因的信号通路也有2条,分别参与ECM受体相互作用和焦点粘连作用。 3.体色分离幼参的unique reads比白色幼参少30522条,这些缺失的unique reads可能会导致白刺参F1代幼参生理状态的差异。相对于同批次白色幼参,在白刺参F1代体色分离幼参体壁中有161个上调基因和111个下调基因。较ALB库,在SEP库中共有42个基因的表达量改变5倍以上,上调的有31个,下调的有11个。上调5倍以上的注释基因有12个,主要与生长发育和转运相关;下调5倍以上的注释基因有6个,主要是线粒体呼吸链组分。相对于白色幼参,在体色分离幼参中有两条显著富集上调基因的信号通路,它们分别与金黄色葡萄球菌感染和补体和凝结级联反应相关。有一条显著富集下调基因的信号通路,它参与吞噬作用。 4. AjCREB基因cDNA全长为2503bp,其中5’UTR为277bp,3’UTR为1262bp,开放阅读框为963bp,可以编码含320个氨基酸残基的蛋白。在AjCREB cDNA序列推导的氨基酸序列中,Gln220至Ala269的氨基酸序列是非常保守的具有典型的α螺旋结构的BRLZ结构域。AjCREB与其他物种的同源性较低,与其一致性最高是Homo sapiens(I=16.1%),与其进化地位接近的Strongylocentrotuspurpuratus的一致性仅为10.7%。AjCREB单独聚在在构建的进化树的一支中,而在这一支中S. purpuratus与S. kowalevskii聚在一起。 这些研究成果将为深入开展刺参cAMP黑色素合成调控通路、外界环境对白刺参生长发育影响和白刺参免疫能力的研究提供候选基因,为可以稳定遗传的生长良好的白刺参品系的培育打下坚实的理论基础。


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