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红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)血细胞培养及细胞免疫学研究

段虎  
【摘要】:血细胞是甲壳动物的细胞免疫的执行者,在先天免疫中扮演着重要角色。由于生存环境的复杂性,如外界环境压力、蜕皮等生理过程、病原感染以及争斗等,都会引起血细胞数量和组成的变化。细胞培养是目前虾类病害研究能否深入的关键因素之一,由于缺乏稳定而实用的体外培养体系,深入研究病原与宿主的关系变得十分困难。 螯虾个体大,易于室内养殖,取材简单方便等特点日渐成为甲壳动物细胞培养及相应工作的首选。本研究以红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)为材料,选取其血细胞和造血组织(细胞)优化培养条件,进行体外细胞培养研究。同时,以原代培养的血细胞和造血组织细胞进行了白斑综合症病毒(WSSV)感染等相关实验。研究的主要目的在于:为深入研究虾类血细胞的先天免疫方式及造血组织的发育分化等奠定基础。 本研究的主要结果如下: (1)血细胞主要分为三种类型:透明细胞,半颗粒细胞和颗粒细胞;两步密度梯度离心后,获得了三种不同的细胞亚群。其中,颗粒细胞聚集的65%Percoll层,纯度超过99%;第二次密度梯度离心后,半颗粒细胞聚集35%Percoll处,半颗粒细胞的纯度约为83%,而在上层,透明细胞纯度约90%; (2)优化了血细胞体外培养条件,确定了两种不同的改良的L-15培养基分别为螯虾血细胞和造血组织的优化培养基。体外培养时,在颗粒细胞不存在的情况下,透明细胞和半颗粒细胞存活时间可以达到7天并维持较高的活力,7天后仍可以保持70%;对于颗粒细胞而言,细胞体外存活3天,细胞仍有较高活力,细胞活力超过50%;而仅仅过夜培养,细胞不会出现脱颗粒,细胞活力在80%左右; (3)Beads挑战实验结果表明:颗粒细胞是一种吞噬细胞。颗粒细胞吞噬体形成有一个完整的过程,主要包括以下四个阶段:接触,吞噬“杯”的形成,伪足的延伸,吞噬体的关闭和形成;这个结果也表明:颗粒细胞对Beads的吞噬过程主要通过伪足完成; (4)当颗粒细胞和E.coli孵育后,小的E.coli (约0.5μm)可以直接通过细胞膜的内陷进入颗粒细胞吞噬,这是一种较为典型的吞噬方式;而较大的E.coli (1μm)则可能是以巨胞饮的方式进入颗粒细胞;大的细菌主要是通过伪足的拖拽进入细胞,成团的大肠杆菌则出现了2个甚至多个颗粒细胞“争夺”的现象; (5)TEM结果表明,病毒颗粒以病毒囊泡的形式存在于颗粒细胞的细胞质中;更高的放大倍数,成团的内含正在成熟的和已经成熟的病毒粒子存在于颗粒细胞的细胞质中,甚至可以清楚地看清病毒的形态,说明WSSV可以进入颗粒细胞,病毒是否在细胞中复制目前仍不清楚; (6)LSCM结果表明:和对照组相比,抑制剂氯丙嗪(CPZ)不能有效抑制WSSV进入颗粒细胞,说明WSSV进入颗粒细胞的主要方式不是网格蛋白介导细胞内吞作用;和对照组相比,用2mg/ml甲基-β-环糊精(MβCD)处理颗粒细胞后,再和FITC标记的WSSV孵育,LSCM检测颗粒细胞,几乎没有带有荧光的WSSV,说明WSSV主要采用小窝介导的细胞内吞作用进入颗粒细胞; (7)红螯螯虾的造血组织细胞也可以感染WSSV,病毒可以在细胞中完成复制,复制的部位在细胞核,复制完毕后在细胞质中出现巨大的病毒包涵体; (8)利用造血组织细胞,采用三种转染试剂转染EGFP,只有Fugeng HD细胞阳性率接近3%,其他两种都不足1%; (9)和颗粒细胞相比,造血组织细胞病毒载量大,对外源beads的作用方式二者存在差异,造血组织主要依靠细胞表面形成褶皱来完成对beads的绑定,尽管也发现有些细胞可以利用伪足来吞噬,可能是发育较为成熟的血细胞前体; (10)本研究应用solexa高通量测序技术对红螯螯虾造血组织进行了转录组测序和基因表达谱分析。最终获得了29,060,562个reads (5.8Gb)的转录组数据和57,884,811reads (2Gb)的表达谱数据,根据Gene Ontology (GO)和KEGG Pathway分析发现,大量的unigenes参与或涉及了不同的生物学过程,推测有些unigenes在细胞周期,分裂以及细胞分化等生物学过程中发挥着重要功能。通过分析表达谱数据,得到筛选显著差异表达信息49条,其中与cell cycle等相关为44条,它们可能参与细胞周期以及细胞的分裂分化等相关过程;而与病毒复制信息相关为5条。 本论文开展了红螯螯虾血细胞和造血组织的相关研究,研究有助于深入了解其他甲壳动物的细胞免疫反应,以及病毒与细胞的相互作用方式,造血组织的发育分化以及在这个过程中可能参与的基因等。


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