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糖原代谢相关基因在中华绒螯蟹免疫应答中的调控作用

李晓炜  
【摘要】:免疫系统持续地感知和应答环境的威胁,需要消耗大量的能量,能量缺乏会导致免疫系统抑制和抗性降低,所以免疫反应过程中能量的调节十分关键。PI3K/Akt信号通路过去被认为是重要的代谢调节通路,在糖原代谢中发挥关键作用,近年来的研究发现PI3K/Akt参与了对于炎症的调节。与PI3K/Akt关系紧密的RAS/ERK信号通路亦被证明对炎症的发展起重要的调控作用。本研究以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为研究对象,利用分子生物学和生物信息学等手段,研究糖原合成酶激酶3以及其上游的两种调控激酶蛋白激酶B(Akt)与细胞外信号调节激酶2(ERK2),探索PI3K与ERK信号通路在中华绒螯蟹固有免疫反应中所发挥的作用。糖原合成酶激酶-3(GSK3)是催化丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶,最早被鉴定为糖原合成的调控分子。本研究从中华绒螯蟹中克隆了GSK3同源基因(命名为EsGSK3)。其开放阅读框长1824 bp,编码一个具有607个氨基酸的蛋白质。在EsGSK3中存在保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和DNA结合结构域。EsGSK3首先与日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的GSK3-β聚类后纳入无脊椎动物分支,与来自脊椎动物的GSK3s形成不同的分支。在中华绒螯蟹的肝胰腺、眼柄、肌肉、性腺、血细胞和造血组织中均可检测到EsGSK3的mRNA表达,其中在肝胰腺中的表达水平最高,且EsGSK3蛋白主要定位于血细胞的细胞质中。EsGSK3 mRNA表达水平在嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)刺激后6小时显著升高(p0.05),在48小时后逐渐降至初始水平(p0.05)。脂多糖诱导的肿瘤坏死因子(TNF)-α因子(EsLITAF)的mRNA表达水平在嗜水气单胞菌刺激后显著升高。然而,利用特异性抑制剂锂抑制EsGSK3的活性后,中华绒螯蟹肝胰腺中糖原水平显著增加(p0.05),血淋巴上清中葡萄糖的含量显著下调,血淋巴细胞中的EsLITAF mRNA表达水平和血清中TNF-α含量均受到显著抑制,而血淋巴细胞中核因子κB抑制剂(IκB)的mRNA表达水平显著上升(p0.05),血细胞的吞噬率显著升高,过氧化氢酶、碱性磷酸酶活性以及一氧化氮(NO)合成的增强。作为GSK3通路上游的激酶,细胞外信号调节激酶(ERK)被认为是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中一系列基因代谢的调节因子。从中华绒螯蟹cDNA文库中鉴定出ERK的同源基因,命名为EsERK。其开放阅读框全长为1746 bp,编码581个氨基酸组成的多肽。分别分析了体内EsERK的mRNA在受嗜水气单胞菌刺激和dsRNA干扰后的表达变化。发现在嗜水气单胞菌刺激6小时后,中华绒螯蟹血淋巴细胞中的EsERK mRNA表达水平显著升高(p0.05),在48小时逐渐降低(p0.05)。对EsERK进行RNA干扰24小时后,中华绒螯蟹肝胰腺中糖原水平显著增加(p0.05),血淋巴上清中葡萄糖的含量显著下调,血淋巴细胞中核因子κB抑制剂(IκB)的mRNA表达水平显著上升(p0.05),超氧化物歧化酶活性显著升高(p0.05)。在抑制EsGSK3活性6小时后,中华绒螯蟹血淋巴细胞中EsIκB的mRNA表达水平显著从中华绒螯蟹cDNA文库中鉴定出蛋白激酶B(Akt)基因,并将其命名为EsAkt。其开放阅读框全长为1395 bp,编码一个具有464个氨基酸的蛋白质,其理论分子量为53.17 kDa,理论等电点为5.83。基于RT-PCR分析,在所有检测的组织,包括血细胞,性腺,肝胰腺,鳃,肌肉和眼柄中均检测到EsERK基因mRNA表达,其中在肌肉的表达水平最高。在受到嗜水气单胞菌(A.hydrophila)刺激12小时后,中华绒螯蟹血淋巴细胞中EsAkt的mRNA表达水平显著升高(p0.05)。以上结果表明,EsGSK3可以通过诱导TNF-α产生,抑制血细胞吞噬作用,并调节免疫相关酶的活性及NO的合成调控中华绒螯蟹的固有免疫应答反应。EsERK可以通过调节IκB和TNF-α转录因子的表达参与免疫应答,抑制它们的作用会对通过PI3K/Akt与Ras/ERK通路导致的炎症反应造成影响。此外EsAkt亦表现出对于菌刺激的响应。本研究首次揭示了GSK3、ERK及Akt作为糖原代谢相关通路的关键调节分子,在调节中华绒螯蟹的固有免疫应答中发挥作用,为深入研究PI3K与ERK信号通路在感染防治及炎症控制中的作用提供了基础。


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