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雨生红球藻控制虾青素合成的关键酶基因的转录调控元件

滕长英  
【摘要】: 虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素,具有广泛的应用价值。单细胞绿藻——雨生红球藻在环境胁迫条件下可以合成积累虾青素,含量高达细胞干重的4%,是其他生物的一到几个数量级,成为目前首选的天然虾青素合成工具。 近年来,国内外对雨生红球藻的培养条件及虾青素的诱导条件进行了大量研究,发现虾青素的大量积累总是发生在不适于生物量积累的环境胁迫条件下,虾青素积累与生物量积累之间成为一对矛盾,制约着虾青素大量生产。 红球藻中虾青素的合成是在一系列酶的作用下合成的,其中β-胡萝卜素酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶是合成过程的两个关键酶。已有实验结果证明,虾青素的合成调控至少部分发生在合成酶基因的转录水平上,提示从分子水平上研究虾青素合成酶的转录调控机制,将有可能为人工调控虾青素的代谢提供新思路。 本文根据国外已经获得的两个关键酶全长cDNA序列,利用长距离PCR法和接头引物PCR法,从红球藻基因组中扩增到并克隆了两个关键酶的基因组序列和5'上游侧翼序列,在建立雨生红球藻瞬间表达系统的基础上,对所获得的5'上游侧翼序列进行外源基因调控功能验证。本论文工作成功地克隆两个关键酶基因的基因组序列,发现crtW和crtZ分别包括6个和5个内含子序列,所有这11个内含子的剪切位点都符合GU-AG规律。分离到两个crtW 5'上游序列和一个crtZ上游序列,长度分别为795bp、695bp和302bp。以lacZ为报告基因的瞬间表达实验结果表明,长度分别为306bp和302bp的crtW和crtZ 5'上游侧翼序列具有很强的启动转录活性,提示两段序列包含了启动子的结构。


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