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坛紫菜丝状孢子体EST的获取、生物信息学分析及功能基因的克隆和序列测定

庞国兴  
【摘要】:本文采用改进的一步法从坛紫菜丝状孢子体中提取总RNA,使用Oligotex mRNA Kits(QIAGEN) 分离mRNA,经过一系列酶促反应合成双链cDNA,通过QIAEXII GEL Extraction Kit (QIAGEN)胶回收大于500 bp的片段,连接到载体pBluescript SK(+),转染宿主菌DH 10B,成功地构建了坛紫菜丝状孢子体的cDNA文库,获得了2.5×105个原始克隆。测序得到1280个EST,这些EST拼接出的叠连群(多拷贝EST)有91个,单拷贝EST有399个,做Blastx和NCBI非冗余蛋白库比对(e-value1e-5),叠连群和单拷贝EST一共有275个比对上,占56.1%。将490个contig和singlets与GenBank中2万余条条斑紫菜EST进行比对,比对上的序列有260个,占53.0%。 坛紫菜490个叠连群和EST平均GC含量为58.9%,挑选出28个EST,所包括密码子数为3221个,这些密码子第三位平均GC含量是73.1%,密码子第二位平均GC含量是42.0%,密码子第一位平均GC含量是58.5%,密码子第三位的GC含量远远高于第一位和第二位的GC含量。统计坛紫菜丝状孢子体3221个密码子的密码子使用频率表。 根据已有数据分析,坛紫菜可能为了保持基因组双螺旋结构的稳定性或者为了选择密码子和反密码子之间一种合适的作用力,经过漫长的生物进化,形成了现在高GC含量的基因组,类似的现象在条斑紫菜和其它的红藻中也有发现,这种特性对寻找坛紫菜蛋白质在基因组中的编码区域具有重要的指导意义。通过比较分析坛紫菜丝状孢子体与条斑紫菜叶状体的EST,发现虽然坛紫菜丝状孢子体与条斑紫菜叶状体生长环境不同,而且属于不同的种和不同的世代,但二者EST的GC含量、密码子便好性等具有很高的相似性。 根据其它物种磷酸甘油酸脱氢酶的序列的保守区,使用Primer 5软件,设计了该酶的正反向引物,并得到了磷酸甘油酸脱氢酶的部分基因序列,并在GenBank中和其它物种的同类基因序列比对。与此序列相似度最高的序列是红海束毛藻Trichodesmium erythraeum的磷酸甘油酸脱氢酶的基因序列(ACCESSION number: ZP_00073958),E-value为:4e-25,相似性为:30%,Score为:117。


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