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海洋生物附生细菌活性代谢产物研究

郑立  
【摘要】:本文从开发海洋药物及探询药源问题出发,针对我国沿海特殊来源的微生 物――海洋生物附生细菌开展了一系列的探索性研究。我们通过抗菌、细胞毒的 筛选发现在不同来源的海洋细菌中,海洋生物的附生细菌中具有活性细菌的比例 较高;在这些活性细菌中又有 4 株具有抗 SARS 病毒活性,7 株具有抑制微藻的活 性。通过细菌 16S rRNA 序列分析,大部分活性细菌的系统学地位与 Pseudoalteromonas sp.和 Bacillus sp.的较接近。 以海绵附生细菌 Pseudoalteromonas sp. NJ6-3-1 作为研究对象,研究了它在不 同培养条件下代谢产物的抗菌和细胞毒活性,以及细胞脂肪酸组成和含量的变化, 同时比较了脂肪酸和分子鉴定在海洋细菌分类中的差异,探讨脂肪酸在海洋细菌 鉴定中的可行性。实验结果表明 NJ6-3-1 代谢产物的抗菌、细胞毒活性随着培养条 件的改变而改变,其中的活性成分含量并不与其生物量成正相关。在不同的培养 条件下,细菌 NJ6-3-1 的脂肪酸组成没有太大变化,但其含量却有较为明显的差异, 特别是温度对细菌脂肪酸的影响很大,表现在不饱和脂肪酸和奇数脂肪酸含量随 温度的升高而降低。对 14 株代表性海洋细菌进行脂肪酸组成与其 16S rRNA 序列 的聚类分析可以看到,海洋细菌在用这二种方法确定到属时,具有相同归属,但 在种间却有一定的差距,这说明利用脂肪酸的组成和含量可以用于海洋细菌鉴定 到属的聚类分析。 在 30L 发酵罐中对细菌 Pseudoalteromonas sp. NJ6-3-1 进行发酵培养,利用各 种分离手段对其代谢产物进行了纯化,共得到 13 个纯化合物,运用一维核磁共振 (1HNMR、13CNMR、DEPT)、二维核磁共振(HHCOSY、HMBC、HMQC)、 质谱(EI/MS)等现代波谱分析技术对化合物的结构进行了鉴定。结果表明这些化 合物属于生物碱、甾醇和有机酸类物质,其中有两个为新化合物。部分化合物曾 在海绵等无脊椎动物中发现,本文是首次报道它们也存在于海绵附生细菌中。在 这些化合物中有 6 个具有抗菌和细胞毒活性,尤其是 norharman ,具有显著的抗 1 WP=4 中国科学院海洋研究所博士论文 海洋生物附生细菌活性代谢产物研究 菌和细胞毒活性。 以宫颈瘤细胞系 Hela 为对象,首次研究了细胞毒化合物 norharman 的抗肿瘤 机理,通过吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色、DNA Ladder、末端荧光标记实验 (TUNEL)证明了 norharman 能够引起细胞 DNA 的断裂,诱导细胞凋亡;流式细 胞仪对细胞周期的分析显示 norharman 处理 48 小时后的细胞不能进入 S 期复制, 该结果说明 norharman 具有与细胞 DNA 结合的能力,从而造成 DNA 损伤,在细 胞进入 S 期时引发凋亡。 本文从海洋生物附生细菌的分离开始、进行了代谢产物生物活性筛选、细菌 分子鉴定及脂肪酸分析,研究了海洋细菌活性产物的代谢并鉴定了代谢化合物的 结构,最后对细菌的细胞毒代谢产物进行了抗肿瘤机理细胞凋亡的研究,这项工 作不仅完善了一套进行海洋微生物活性天然产物研究的系统方法,为开发具有药 用潜力的天然化合物建立模型,也为海洋微生物作为海洋活性物质的药源提供新 的依据。


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