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花鲈和军曹鱼部分细胞因子基因的克隆及表达特征研究

邱丽华  
【摘要】:本论文以我国海水经济鱼花鲈 Lateolabrax japonicus 和军曹鱼(Acanthopagrus schlegeli) 为研究对象 采用同源克隆 快速扩增 cDNA 末端技术 Rapid amplification of cDNA ends RACE 和半定量 RT-PCR 技术 对白介素 1a Interleukin 1a, IL-1a 肿瘤坏死因子 á Tumor necrosis factor, á TNFá 和翻译肿瘤调控蛋白 Translationally control tumor protein, TCTP 等基因进行克隆及表达特征研究 现将主要结果分述 如下 1 花鲈和军曹鱼 I L - 1 c D N A 的克隆与表达 花鲈 IL-1a cDNA全长 1310bp 包括一个 136bp 的 5’末端非编码区 untranslated region UTR 和一个 430bp 的 3’ UTR 其开放式读码框 open reading frame, ORF 长 774bp 可编码 258 个氨基酸组成的白介素 1a 前体蛋白 预测分子量为 29.31kDa 等电点为 5.64 军曹鱼 IL-1a 的 cDNA全长 1,104 bp 3ˊUTR 为 255 bp 5ˊUTR 为 108 bp ORF 为 738bp 编码 246 个氨基酸 分子量大约为 27.68kDa 理论等 电点为 5.71 同源性分析表明克隆的花鲈和军曹鱼 IL-1a cDNA序列与其它鱼类甚 至哺乳动物的 IL-1a 基因具有很高的相似性 预测蛋白都包含有 1 个 IL-1a 家族的 签名序列 signature 并与其它非哺乳类动物的 IL-1a 一样缺乏信号肽和白介素 1a 转换酶 interleukin 1a converting enzyme ICE 切点 空间结构分析发现 花鲈和 军曹鱼 IL-1a 与哺乳类 IL-1a 有相似的空间结构 即由 12 个 a 折叠片组成的三叶草 结构 表明从花鲈和军曹鱼中克隆得到的 cDNA序列是 IL-1a 家族的成员 半定量 RT-PCR 检测表明花鲈和军曹鱼 IL-1a 在大多数组织中均为组成型表达 LPS 或虹 彩病毒 Iridovirus 刺激后 IL-1a 在部分组织中的表达水平可显著加强 说明 IL-1a 存在组成型和诱导型两种表达机制 在花鲈和军曹鱼防御细菌或病毒的感染过程中 发挥重要作用 2. 花鲈 TNF cDNA 的克隆与表达 利用同源克隆和 RACE 技术克隆到花鲈 TNF cDNA 的全长序列 序列全长 990 bp 3ˊUTR 为 192 bp 5ˊUTR 为 72 bp ORF 为 723 bp 可编码 241 个氨 基酸 分子量大约为26kDa 同源性分析表明该序列与其它鱼类甚至哺乳动物的TNF 基因具有很高的相似性 并含有 TNF 家族的签名序列 signature 在氨基酸序 A WP=5 邱丽华 花鲈和军曹鱼部分细胞因子基因的克隆及表达特征研究 博士学位论文 列中发现一个潜在的跨膜区域 半定量 RT-PCR 检测发现 LPS 和虹彩病毒都可以 诱导 TNF 基因高水平的表达 但是在不同组织内的表达存在差异 LPS 刺激后表 达较强的组织是头肾和脾脏 而病毒感染后 TNF 在肝脏中的表达较强 结果表明 花鲈 TNF 基因存在组成型和诱导型两种表达调控机制 在抵御病原感染过程中发 挥重要作用 3 花鲈 TCTP cDNA 的克隆与表达分析 利用同源克隆技术和锚定PCR技术从花鲈中克隆到 TCTP基因的全表达序列 基因 cDNA全长 994bp 3ˊUTR 为 433 bp 5ˊUTR 为 47 bp ORF 为 510 bp 可编码 170 个氨基酸 分子量大约为 19.253kDa 理论等电点为 4.55 序列分析可 以看到 TCTP 家族的签名序列 一个 N-glycosylation 位点 和 5 个 Casein kinase II phosphorylation 位点 同源性分析表明花鲈 TCTP 基因与斑马鱼等其他物种甚至哺 乳类都有较高的相似性 利用 RT-PCR 技术 对 LPS 刺激下该基因在鱼体内的表达 情况进行了初步研究 发现 TCTP 基因在鱼体的多种组织中都有表达但存在差异 而经过 LPS 刺激后目的基因在组织中的表达明显增加 结果表明基因存在组成型和 诱导型两种表达调控机制 同时说明基因在花鲈抵抗细菌入侵感染的免疫反应中起 到一定的作用


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