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新型重组别藻蓝蛋白亚基的表达和生物活性的初步研究

任育红  
【摘要】:为了研究重组别藻蓝蛋白?镭普克(recombinant allophycocyanin,rAPC)的抗肿瘤机理及筛选更强的抗肿瘤蛋白,本实验进行了重组别藻蓝蛋白及其亚基基因分别在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达、表达产物的性质及生物活性的初步研究。 将 apc 克隆到表达载体 pPIC6αA 中,用氯化锂法转化毕赤酵母菌株 X-33,Western blot 检测工程菌的培养基上清液,表明重组别藻蓝蛋白(YAPC)由两种亚基组成,相对分子质量分别为 19kD 和 21kD;5 mmol/L LaCl3使表达量提高110%,同时缩短了最适培养时间,摇瓶培养 48h 最高表达量为 4.4 mg/L。 重组大肠杆菌 P2、P3 和 PMBP 表达的新型重组别藻蓝蛋白亚基 MαAPC 和 MβAPC 以及 rMBP,用 Amylose 亲和层析分离纯化,经 SDS-PAGE 和 HPLC 检验纯度达 88%以上;相对分子质量分别为 61kD,61kD 和 43kD;最大吸收波长分别为 275nm、285nm 和 281nm;经 Western blotting 检测,MαAPC和 MβAPC具有与天然 APC 相同的免疫原性。 含 pET-28a/APC 载体的大肠杆菌 P4表达的重组别藻蓝蛋白 HAPC,经金属螯合亲和层析法分离纯化,纯度达 90%以上;其α亚基和β亚基的相对分子质量分别为 21kD 和 17kD;HAPC 最大吸收波长为 235nm;具有与天然 APC 相同的免疫原性;邻二氮菲—Fe2+氧化法和邻苯三酚自氧化反应速度测定结果显示:HAPC 具有较强的清除羟自由基和超氧阴离子自由基的能力;药理生理学实验结果显示:HAPC 具有显著升高白细胞活性和一定的肿瘤抑制活性。 运用 MAPPP 和 ProPred 及 ABCpred 服务器对 HAPC 和 rMBP 中的 T 细胞表位和 B 细胞表位进行了预测,结果显示两种重组蛋白都有多种通用 T 细胞表位和 HLA 限制性表位及 B 细胞表位,提示具有免疫促进功能,为确定免疫药理靶点奠定了基础,可作为多抗原肽疫苗有一定的应用前景。 本文实现了重组别藻蓝蛋白基因在毕赤酵母中的异源表达。首次发现 LaCl3可增加毕赤酵母表达系统的表达水平,从而有效地降低成本并缩短生产流程。重组别藻蓝蛋白及亚基的表达、纯化方法的建立及生物活性的初步分析,为深入研究重组别藻蓝蛋白的抗肿瘤机理以及开发基因工程新药奠定了基础。


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