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赤潮藻的分子标识及荧光原位杂(FISH)技术在检测赤潮藻中的应用

张宝玉  
【摘要】:赤潮(Red tide)现象在近 20 年中的发生频率、强度以及地理分布都在逐渐增加,它对国民经济、人类健康以及海洋生态环境所造成的巨大影响使得赤潮现象已成为全球共同关注的环境问题之一。 研究赤潮,进而预防和控制赤潮,最根本的问题是要明确引发赤潮的物种。最近几年采用分子生物学技术鉴定海洋浮游植物,特别是对赤潮藻的研究证实它们已成为微型藻类形态特征观察研究的重要补充手段。 本论文通过对一些原甲藻株和硅藻藻株的 ITS 序列、5.8S rDNA 或 LSU rDNA进行 PCR 扩增、克隆和序列测定。在 NCBI 数据库中进行同源性检索,序列的比对及相似性分析采用软件 Bioedit、DNAStar、Phylip3.5、Mega 2.0 等,系统进化关系分析采用 NJ(Neighbor Joining)法构建系统进化树。核酸序列的获得一方面是希望通过分子生物学的方法对一些通过形态鉴定的赤潮藻的命名进行验证,更重要的是找出引发赤潮的主要物种的特异性序列或区域,为下一步定性定量检测方法,主要是 FISH 技术中设计种特异性探针提供更多的选择区域。研究结果如下: 1. 采用 ITS 和 5.8S rDNA 序列研究 2 株海洋原甲藻和 3 株海洋硅藻 (1)海洋原甲藻 APBM(Prorocentrum micans APBM)的 ITS 和 5.8S rDNA 的长度为 631bp,而东海原甲藻(P. donghaiense)的相应部位的碱基长度为 552bp;东海原甲藻与从 GenBank 中获得的微小原甲藻相似程度较高为 88%,与甲藻属其它原甲藻相似程度较低(约 60-70%);本文研究的海洋原甲藻 APBM 的 ITS 序列与其它原甲藻相似程度都较低(约 30%左右)。用 ITS1 或 ITS2 序列构建的系统树与用 ITS+5.8S rDNA 序列构建的系统树反映的结果基本一致,系统进化树反映的结果与序列相似性的结果基本一致。5.8S 区因过于保守似乎不适于构建系统树反映种下的亲缘关系。 (2)尖刺拟菱形藻的 ITS 和 5.8S rDNA 全长为 693bp,SK-1(分离自东海赤潮爆发区)测序得到715bp;SK-2(分离自青岛养殖场) 的ITS和5.8S长度为331bp。


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