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雨生红球藻中虾青素合成关键酶基因的顺式作用元件研究

孟春晓  
【摘要】:虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素,具有广泛的应用价值。雨生红球藻是一种单细胞绿藻,在多种逆境胁迫条件下能够大量合成并迅速积累虾青素,其积累量最高可达细胞干重的 4%,从而成为目前最理想的天然虾青素合成工具。β-胡萝卜素羟化酶(CRTR-B)和 β-胡萝卜素酮化酶(BKT)是两个关键酶,它们共同作用转化 β-胡萝卜素形成氧化型类胡萝卜素——虾青素。已有研究结果表明,这两个合成酶基因的表达调控至少是部分发生在转录水平上的,这就为我们从转录水平上研究虾青素生物合成关键酶基因的调控机制提供了重要线索。近年来,通过基因组上游步移技术已经克隆了长度分别为 306bp 和 302bp的 bkt 和 crtR-B 基因的启动子类似区,从而为这两个关键酶基因的 5’上游侧翼序列的继续步移和顺式作用元件的功能鉴定建立了基础(滕长英,博士学位论文)。 本文在上述工作基础上,通过利用基因组上游步移技术对这两个关键酶基因分别进行了步移,克隆了 crtR-B 基因的一个 5’上游侧翼序列(900bp),对其启动子类似区(-378/-22)中包含的三种功能元件的定点突变结果表明,ABRE(脱落酸反应元件)元件对于基因自身转录可能存在一定影响;同时运用缺失突变并结合瞬间表达技术验证了 crtR-B 基因 5’上游侧翼序列中可能包含的抑制子区(-919/-378)。 我们同样利用基因组上游步移技术克隆了bkt基因两个不同的5’上游侧翼序列(1.5kb 和 2kb),发现这两个不同 5’上游侧翼序列中的许多功能元件类似于高等植物胁迫诱导基因中的顺式作用元件;对其启动子类似区(-630/-308)中两种功能元件的定点突变结果发现 APE-like(蓝光调控元件)对于 bkt 基因自身的转录可能存在影响。通过进一步阐述 bkt 基因至少存在两种不同的转录调控方式参与雨生红球藻中虾青素的合成,还分别针对这两个不同的 5’上游侧翼序列构建了一系列的缺失突变体,结合 lacZ 为报告基因的转化手段,分别验证了其中可能包含的增强子区或抑制子区;同时证明了 1.5kb 大小 5’上游侧翼序列对应 ATG下游的第一个内含子(+371/+497)可能是控制 bkt 基因转录的抑制子。 这些工作为下一步继续寻找与上述特定 DNA 调控区域特异结合的反式作用因子(蛋白质因子)奠定了基础。


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