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mRNA体外展示技术筛选胸苷酸合成酶RNA亲和肽的研究

阎松  
【摘要】:胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,TS)是生物体内催化胸苷酸合成所必需的酶,多年来一直作为肿瘤化疗的重要靶酶。对TS基因调控机制的研究表明:基因扩增、转录、翻译和翻译后过程都参与了TS表达的调控。除具催化活性外, TS还是一种RNA结合蛋白,TS可与自身的mRNA结合形成TS-mRNA复合物,使mRNA翻译受阻。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)等抗代谢药物可与TS蛋白结合,结合后的复合物不能与TS mRNA作用,使上述负反馈调控机制丧失,导致体内TS的表达升高,这种翻译自调控模型是肿瘤细胞产生抗药性的重要分子机制之一。 应用展示技术筛选不同功能的核酸、肽和蛋白是近年的研究热点,目前应用的展示技术包括噬菌体展示技术、核糖体展示技术及mRNA体外展示技术等。mRNA体外展示是一种新兴的高效多肽选择技术,其基本原理是通过含嘌呤霉素寡核苷酸的Linker使mRNA与它编码的肽或蛋白共价结合,形成mRNA-蛋白质融合体,从而实现基因表型(RNA)与蛋白表型(多肽)的结合。这一方法已用于多种功能肽的鉴定。 以mRNA体外展示技术进行了由大容量多肽库中(1013)筛选胸苷酸合成酶RNA亲和肽的研究,通过合理的实验设计,建立了一套完整有效的筛选方法,并对实验时机、条件进行了优化,对文库构建、融合肽生成及筛选方法等问题也作了探讨。 对随机库进行了12轮循环的选择及扩增,并对第8个和第12个循环的选择肽进行了测序及二级结构预测。结果表明,与初始库相比,选择循环之后碱性氨基酸含量明显增加,而且一半以上的序列含有碱性氨基酸对,芳香族氨基酸中的苯丙氨酸含量也明显增加。选择肽中碱性及芳香族残基的增加必然在TS RNA与蛋白的相互作用中扮演着重要角色。12轮循环选择肽的完全随机序列中,第12位的精氨酸占53%; 按理化特性对每一随机位点的氨基酸进行分类,并与初始库比较,发现位点1,12,17和18具有明显的带正电荷的特性,表明碱性侧链参与了RNA的结合。二级结构预测表明,随着筛选的进行,与TS RNA亲和的多肽显示出明


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