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胸苷酸合成酶和二氢叶酸还原酶mRNA亲和肽的发现及mRNA体外展示技术的优化

王征  
【摘要】: 胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,简称TS)和二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,简称DHFR)都是叶酸依赖性酶,在维持DNA合成和DNA修复上发挥关键作用,并且多年来一直是肿瘤研究和化疗的重要靶点。我们前期的研究发现,TS和DHFR在翻译水平上存在负反馈调控机制。人TS和DHFR可以与其自身的mRNA结合,从而抑制mRNA的表达,化疗药物可以与TS或者DHFR相互作用,形成的复合物不能与TS mRNA结合,使负反馈机制丧失。因此深入研究TS和DHFR的翻译调控机理,对阐明肿瘤抗药性机制,对发现新的抗肿瘤药物和肿瘤的治疗都具有十分重要的意义。 本论文利用mRNA体外展示技术,构建多肽库(约10万亿种多肽分子),利用多种实验手段将mRNA体外展示技术进行优化,提高了多肽库融合肽的产量,提高了mRNA体外展示技术筛选的特异性。将TS mRNA分子上的顺式因子TS30 RNA固定于磁珠上,将融合肽库与顺式因子作用,经过6轮循环,由多肽库中获得了与TS mRNA高度亲和的多肽序列,体外结合实验证明亲和肽可以与TS全长mRNA结合,体外翻译实验证明多肽可以抑制TS mRNA的翻译。并且利用phage display技术由噬菌体肽库(12个氨基酸随机肽库)经过四轮筛选,分别筛选到TS和DHFR的亲和肽,凝胶阻滞实验证明它们分别能与TS和DHFR mRNA结合。 本论文利用的展示技术可以广泛应用于特异靶点的蛋白质筛选,并且本论文筛选到的TS和DHFR亲和肽可以作为TS和DHFR的抑制剂,从而为获得新型的抗肿瘤药物奠定基础。


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