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海洋放线菌来源的化合物卡拉霉素(Kalamycin)的抗肿瘤作用和机制研究

张伟杰  
【摘要】: 海洋生态环境的特殊性决定了海洋中往往含有结构奇特、新颖的化学物质,海洋药物具有药理特异性、高活性和多样性,已成为药物研发热点领域,海洋抗肿瘤药物也是其中之一。卡拉霉素(kalamycin)来源于海洋放线菌M097的聚酮类化合物,我们实验室用体外增殖抑制试验发现了卡拉霉素(kalamycin)的抗肿瘤作用。有报道其类似物lactoquinomycin和frenolicin B是肿瘤靶点AKT抑制剂,并由此推断吡喃萘醌骨架在AKT抑制过程中发挥主要作用,我们发现虽然卡拉霉素(kalamycin)含有吡喃萘醌骨架,但是并不抑制AKT及其下游信号系统;继而对卡拉霉素(kalamycin)的体外抗肿瘤作用及其机理进行了系统的分析。 采用磺酰罗丹明B(SRB)法检测卡拉霉素(kalamycin)对10株肿瘤细胞株的体外增殖抑制作用,结果表明,卡拉霉素(kalamycin)能明显抑制各种组织来源的肿瘤细胞生长,具有广泛的细胞增殖抑制作用,除对一株肺癌细胞A549抑制作用不明显外,对9株肿瘤细胞株的IC50平均值为2.5μM,并且对各个细胞株生长抑制曲线形态基本一致。采用流式细胞术证实,卡拉霉素(kalamycin)能剂量依赖地诱导结肠癌细胞HCT-116和肝癌细胞SMMC-7721发生G2/M期周期阻滞,可以诱导黑色素瘤A375细胞发生凋亡。 基于前人的报道,我们用Western blot方法检测卡拉霉素(kalamycin)对AKT信号系统的影响,用量从1μM增加到16μM,AKT、mTOR和磷酸化AKT、mTOR、GSK3β的总量都没有变化;因此我们判断卡拉霉素(kalamycin)不是通过AKT系统发挥作用,而是有另外的机制。细胞凋亡和周期阻滞的很多过程是和P53相关的,我们用卡拉霉素(kalamycin)对P53野生和缺失的HCT-116细胞的增殖抑制和凋亡诱导来分析该抑制作用是否和P53相关,结果显示卡拉霉素(kalamycin)对两种细胞的生长抑制和诱导凋亡作用无明显差异,其作用和P53途径是不相关的。 卡拉霉素(kalamycin)细胞增殖抑制作用的非选择性,表明该化合物是一个广谱的细胞增殖抑制剂。我们用体外酶反应实验分析了卡拉霉素(kalamycin)对拓扑酶的抑制作用,结果显示卡拉霉素(kalamycin)对Topo I没有抑制作用,在20μM时几乎完全抑制Topo II,呈现出显著的浓度依赖效应,抑制作用大约比VP16强十倍。用DNA伸展实验和Topo II介导的负超螺旋pBR322切割实验,证实卡拉霉素(kalamycin)不是DNA嵌入剂和Topo II毒剂,而是一个催化抑制剂。在体外模拟Topo II的催化反应步骤,把整个过程分解,发现卡拉霉素(kalamycin)可以抑制Topo II介导的DNA的切割,但是对再连接没有作用;卡拉霉素(kalamycin)能抑制ATP水解的作用,但是在较高剂量时抑制作用要比阳性对照弱得多。因此,卡拉霉素(kalamycin)可能主要通过抑制Topo II介导的DNA的切割发挥作用。 肿瘤新血管生成是原发性肿瘤赖以发生、生长和转移的物质基础。我们用了多个新生血管生成模型对卡拉霉素(kalamycin)的抗新生血管生成作用进行了检测,发现卡拉霉素(kalamycin)对内皮细胞管腔形有抑制作用,其作用效果呈现明显的剂量依赖性。卡拉霉素(kalamycin)在对内皮细胞HMEC-1在12小时内的IC50是4.39μM ,在没有显著增殖抑制作用的剂量下,对HMEC-1管腔形成依然具有抑制作用,提示卡拉霉素(kalamycin)的抗新生血管生成作用并非完全来源于其增殖抑制作用。通过体外酶反应、western blot和双荧光素酶报告基因系统分析卡拉霉素(kalamycin)抑制肿瘤新血管生成的信号途径,结果发现这种抑制作用不是依赖于酪氨酸激酶和HIF-lα途径的。 综上所述,卡拉霉素(kalamycin)不是一个AKT抑制剂,它通过专一性的抑制Topo II使肿瘤细胞发生周期阻滞和细胞凋亡,主要抑制Topo II介导的DNA的切割和ATP水解作用。同时卡拉霉素(kalamycin)可以抑制肿瘤血管管腔形成,抑制作用不依赖酪氨酸激酶和HIF-lα途径。


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