厌氧发酵产氢菌筛选及产氢菌突变体库构建

【摘要】： 扩大产氢微生物种质资源是生物制氢领域重要的研究课题。本论文采用野生型筛选和转座子诱变产氢菌株的手段,研究混合菌群和纯菌株产氢性质,构建产氢菌株的突变体库,旨在获得高效厌氧发酵产氢微生物,为构建可利用海洋有机废水制氢的工程菌株奠定理论基础。 1培养条件对混合菌群产氢的影响 研究预处理、起始pH值和底物种类对潮间带污泥混合菌群的产氢影响,采用PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析混合菌群组成。在酸、热休克、碱和冻融四种预处理方法中,酸处理条件下富集混合菌群的产氢量最高,混合菌群的优势菌为Clostridium sp.和Bacillus sp.;热休克处理富集混合菌群的优势菌为Clostridium sp.和Enterococcus sp.,碱处理和冻融处理下富集混合菌群的优势菌是Clostridium sp.和Lactobacillus sp.。不同起始pH值对混合菌群产氢量有明显影响,pH值为7.0时,混合菌群产氢量达到最高,其它依次为pH6.5 pH7.5 pH6.0 pH8.0 pH5.5 pH5.0 pH4.5 pH4.0。16S rRNA基因的DGGE分析结果表明,在不同起始pH值条件下混合菌群的优势菌基本相同,NCBI-BLAST比对结果与Clostridium sp.存在较高的相似度(98%)。采用葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉、蛋白胨5种底物进行厌氧发酵产氢,底物为蔗糖时混合菌群的产氢量最高,混合菌群优势菌为Clostridium sp.和Bacillus sp.。 2产氢菌株的分离与产氢条件优化 野生型产氢菌株的分离是扩大产氢微生物种质资源的必要手段。从天津海水浴场潮间带污泥中分离鉴定两株产氢菌。通过形态观察、生理生化特征和16S rRNA序列分析,两株产氢菌分别命名为Bacillus sp.B2和Clostridium sp.T7。在海水培养条件下,起始葡萄糖浓度为20 g/l,pH值为7.0时,菌株Bacillus sp.B2最大产氢量能达到1.65±0.048 mol H2/mol葡萄糖,菌株Clostridium sp.T7最大产氢量能达到1.79±0.062 mol H2/mol葡萄糖。 3成团泛菌突变体库的构建和高效产氢突变菌株的筛选 转座子诱变是获得高效产氢菌的有效途径。利用Tn7转座子体外转座成团泛菌基因组DNA,采用Kan抗性和转座子插入序列鉴定突变菌株。在含卡那霉素浓度为40μg/ml的平板上,随机挑取340个菌落,其中有331株菌通过PCR鉴定证实插入了转座子。产氢菌突变体库的库容量为4.35×108/ml。以产氢量为筛选指标,在已鉴定的331株突变菌中,筛选出一株高效产氢突变菌株TB5,其产氢百分含量和产氢量分别是野生菌株的1.1倍和1.52倍。菌株TB5的产氢最适pH为7.0,而野生菌株为6.0。在成团泛菌Tn7突变体库中,以能利用淀粉产氢为筛选指标,331株突变菌中有17株的产氢能力明显高于野生菌。