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1.地中海拟无枝菌酸菌U32总RNA分离及基因芯片方法初步建立 2.丙氨酸脱氢酶基因克隆、表达及转录分析

姚玉峰  
【摘要】:原核生物的RNA半衰期很短,一般只有几分钟,所以迅速的将细胞裂解并使RNase失活是提取高质量RNA的关键。地中海拟无枝菌酸菌属革兰氏阳性菌,细胞壁含厚厚的肽聚糖层,一般的破细胞方法如SDS,玻璃珠等很难将其充分的迅速破碎,因此采用一般的方法很难分离到完整的RNA。在LiCl/Urea法和一步法的基础上提出了一种适用于革兰氏阳性菌RNA的提取方法。首先利用超声波迅速破碎菌体,然后溶液中高浓度的尿素,异硫氰酸胍和LiCl使RNase失活,并将大分子的RNA沉淀,最后通过酚抽和异丙醇沉淀得到纯化的RNA。电泳检查和Northern结果表明采用此方法得到的RNA样品具有很好的纯度和完整性。 另外我们选取了一些与硝酸盐效应有关或是无关的基因,根据蛋白质序列的保守性,利用地中海拟无枝菌酸菌密码子使用偏好以及第三位偏向G或C的使用特点,设计简并引物,对地中海拟无枝菌酸菌U32总染色体扩增目的基因片段,成功地克隆了磷酸葡萄糖异构酶、乙酰辅酶A羧化酶亚基,丙氨酸脱氢酶等基因。另外用Sau3A1对基因组进行部分酶切,然后连接到载体中,构建U32基因组的质粒文库(约5,000个克隆)。利用以上结果和实验室已经克隆的基因,采用DNA微矩阵技术对地中海拟无枝菌酸菌U32的表达谱进行初步研究,分析在不同生长条件下各代谢途径基因的表达与力复霉素生物合成的关系,以期最终揭示KNO3的全局性调控的分子机理。


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