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锌离子和一些螯合剂对Ryanodine 受体作用的研究

王汇  
【摘要】: 采用[3H]ryanodine结合的实验技术,本工作研究了锌离子和一些二价金属离子螯合剂对骨骼肌和心肌ryanodine受体(RyR)的作用及其机制。 锌离子对[3H]ryanodine与兔骨骼肌重肌质网系囊泡(HSR)膜上的 I型RyR (RyR1)的结合呈双相作用。在[Zn2+]f低于1 (M时,结合值增加,高于1 (M [Zn2+]f抑制ryanodine结合,其半抑制浓度IC50/ZnI为2.7(0.5 (M (平均数(标准差)。抑制浓度的锌离子对ryanodine结合时程也表现双相作用。锌离子对RyR1的双相作用表示RyR1上可能存在两类锌离子结合位点:活化位点和抑制位点。锌离子显著地改变ryanodine结合的钙离子浓度依赖性,而钙离子对ryanodine结合的锌离子浓度依赖性曲线无明显作用。同时,锌离子与其它RyR调节剂对ryanodine结合存在相互作用。这些结果表明,锌离子对RyR1的钙活化位点和失活位点都有调节作用。锌离子对RyR1的双相作用可以被2 mM 巯基还原剂DTT拮抗的结果提示,RyR1上的巯基参与锌离子对RyR1的调控作用,并且RyR1存在内在锌。 锌离子对[3H]ryanodine与牛心肌RyR(RyR2)的结合表现单相抑制作用,其IC50/ZnI为2.1(0.4 (M。锌离子与其它RyR调节剂的相互作用提示,锌离子的抑制作用主要通过抑制钙离子活化位点实现的。由于钙离子浓度的变化不改变锌离子对ryanodine结合的抑制作用,锌离子的作用可能不是通过与钙离子竞争钙离子活化位点,而是通过间接作用实现的。与骨骼肌不同的是,锌离子对RyR2的抑制作用并不能被2 mM DTT取消。 本工作还首次发现,在ryanodine结合实验中为维持恒定自由钙离子浓度经常使用的二价金属离子螯合剂EGTA和TPEN对ryanodine与RyR1 及 WP=3 RyR2的结合均有抑制作用。它们对RyR1的半抑制浓度分别为3.4 ( 0.3 mM 和50 (M。它们的抑制作用和它们与锌离子的亲和力一致,即亲和力越高,抑制作用越强。有意思的是,外加锌离子可以解除5 mM EGTA对RyR1的抑制但外加锌离子仅当存在 GSH(一种巯基还原剂)时,才能够部分解除100 ?M TPEN对RyR1的抑制作用。 本工作不仅表明,锌离子对RyR有调控作用;锌离子对RyR1与RyR2作用的诸多明显差别说明,锌离子对RyR 的作用具有亚型特异性。上述结果还提示,RyR内在锌的存在。并且,内在锌对RyR的正常功能是必需的。此外,高浓度螯合剂抑制ryanodine结合的结果还表明,在ryanodine结合实验中,使用的螯合剂浓度不能过高。


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