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去传入海马的差异表达基因的筛选和Cystatin C表达

应国新  
【摘要】: 为了阐明中枢神经系统损伤后神经可塑性的分子机制,本实验探索了多种方法,包括传统差异筛库、传统cDNA array和cDNA microarray,对穿通纤维切断后大鼠海马的基因表达图谱进行了研究。传统差异筛库在大鼠脑的2300个低丰度表达基因克隆中筛选到了6个在去神经30天海马中差异表达的基因,但Northern blot 没有证实其中任何一个基因为真阳性克隆。Custom cDNA array 筛选的8000个cDNA 克隆中有47个在去神经30天海马显示差异表达且表达变化在3倍以上,其中25个表达上调,22个表达下调; Northern blot 实验表明cDNA array 的假阳性率是较高的。cDNA microarray在大鼠中枢神经系统表达的6234种基因和EST序列中,筛选到了152个基因和EST 序列在去神经10天海马差异表达,表达变化在1.5-2.8倍之间,其中表达上调的32个,下调的120个。这些基因的编码蛋白功能集中在以下几类:免疫反应、环境反应、细胞膜运转、细胞结构、蛋白周转;其他的包括细胞因子与其受体、转录因子、细胞分泌和蛋白分拣、细胞粘连和识别、以及一些和物质代谢有关的分子。挑取部分基因的Nothern blot结果验证了cDNA microarray的可靠性。这些实验结果表明:cDNA microarray对大规模的系统研究中枢神经系统损伤后的基因表达图谱是可行的,同时,本实验为理解去内嗅皮层支配海马神经可塑性的分子机理提供了重要的资料。 Cystatins是内源性的半胱氨酸蛋白酶的抑制剂,它们和半胱氨酸蛋白酶一道调节细胞内外蛋白质的周转,参与了动物体内一系列广泛的和组织重塑有关的生理和病理过程。我们对cDNA array筛选得到的一个靶基因-Cystatin WP=3 C,一个哺乳动物体内主要的半胱氨酸蛋白酶抑制剂,在鼠去内嗅皮层支配3,7,15,30天海马的表达进行了考察。Northern Blot 显示,Cystatin C 信使RNA在去神经海马呈瞬时性的表达上调:术后3天其mRNA开始上调,术后7天和15天增加显著,其mRNA水平分别为对照的219%和185%,术后30天恢复到接近对照水平。原位杂交和免疫组织化学证实了Cystatin C这一表达调节时程。重要的是,原位杂交和免疫组织化学显示:Cystatin C表达上调发生在海马去内嗅皮层支配的靶区,海马的腔隙分子层和齿回的外分子层。Cystatin C原位杂交和GFAP免疫组织化学双标,以及Cystatin C和GFAP的免疫荧光双标实验显示:海马内表达Cystatin C的细胞是去神经激活的星型胶质细胞。随后我们用神经元的原代培养实验检测了Cystatin C对神经元突起生长的作用。这些结果提示:1. Cystatin C的时空表达是去内嗅皮层支配特异诱导的;2. Cystatin C可能和去内嗅皮层支配海马内星型胶质细胞介导的神经可塑性事件有关。


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