胰岛素受体配基结合结构域L1和L2的表达与鉴定及胰岛素原的折叠与解折叠

【摘要】： 本论文分为两大部分，第一部分是胰岛素受体配基结合结构域的表达与鉴定，第二部分是胰岛素原的折叠与解折叠，包括三章。在第一章中我们研究了单链猪胰岛素前体（PIP）在体外的二硫键形成途径，随后在第二章研究了人胰岛素原的体外折叠途径，最后在第三章我们研究了人胰岛素原的解折叠。 第一部分阐述了人胰岛素受体配基结合结构域L1和L2的可溶性表达并鉴定了它们的配基结合能力。由于缺少胰岛素受体胞外部分和受体-配基复合物的详细三维结构，因此对胰岛素的结合和跨膜信号传递的分子机制仍然处于推测阶段。胰岛素受体的(亚基负责与胰岛素的结合，但(亚基的高分子量和高度糖基化是进行晶体结构分析的巨大障碍。为了得到受体-配基复合物的结晶，有必要构建并表达一个适合结构分析的小受体片段。我们注意到，在(亚基上的两个结构域L1和L2对配基结合非常重要，有可能直接与胰岛素结合。因此，我们首先从人胎盘cDNA文库克隆了sL1（1-119位残基）、sL2(311-428位残基)、L1(1-157位残基)和L2（311-470位残基）的基因，然后对sL1和sL2进行表达并制备了针对它们的多克隆抗体。利用了融合表达的手段在大肠杆菌中实现了L1和L2的可溶性表达，经过两步纯化后，可以从500ml的培养液中得到至少1.0mg纯度在95%以上的融合蛋白。用聚乙二醇（PEG）沉淀的方法和表面离子共振（SPR）实时相互作用分析的方法测定了L1和L2的配基结合能力，发现L1和L2或者两者的混合物都不能与胰岛素结合，说明仅有L1和L2不足以形成一个配基结合位点。在SPR测定的时候，发现L2能够与固定在SA5芯片上的Avidin专一性地相互作用，但生理意义并不清楚。 第二部分的第一章中我们研究并推测了猪胰岛素前体（PIP）在体外折叠时二硫键的形成途径。尽管胰岛素的结构研究较为清楚，但在其前体折叠过程中三个二硫键的形成途径仍十分模糊。在含有L-Arg的氧化还原缓冲液中，从完全还原变性的PIP到天然PIP的复性产率可高达85%。当复性反应在不同的时间点终止时，捕获并鉴定了三个较明显的中间体（一个含单二硫键，另外两个含双二硫键）。A链内部的二硫键存在于含单二硫键的中间体中。两个含双二硫键的中间体含有共同的A20-B19二硫键和另外一个A，B链间的二硫键。根据中间体的二硫键配对方式及在复性过程中的时间分布，我们提出PIP在体外折叠时存在两条不同的二硫键形成途径。第一条途径中，A链内部二硫键先快速形成, 然后A，B链间的一个二硫键慢慢形成。一旦A、B链间形成一个二硫键，剩余的两个半胱氨酸迅速配对并完成PIP的折叠。第二条途径以A20-B19二硫键的形成为起始，然后另一个A，B链间的二硫键（可能为非天然的）快速形成。之后，非天然的含双二硫键的中间体的CysA6, CysA7, CysA11和CysB7之间的配对不断调整，直至形成天然的二硫键A6-A11或A7-B7。待剩余的一个二硫键形成后，PIP的折叠完成。 由于胰岛素在体内是以人胰岛素原的形式被合成和折叠的，所以在第二章 WP=3 中我们进一步研究了人胰岛素原的体外折叠途径并推测了胰岛素的折叠起始点和C肽在折叠中的潜在作用。在pH为10.5的氧化还原体系中，HPI在体外的复性产率可以达到84%。在HPI体外再折叠过程中分离到四个主要的中间体P1，P2，P3和P4。对四个中间体的结构分析发现它们都是三个二硫键保持完整的二硫键异构体，其中P1含有两个非天然的链间二硫键，P2，P3，P4分别含有A20-B19，B7-A20和B7-B19二硫键。CD显示P1，P2，P3保留了40%左右的天然(-螺旋，P4则几乎没有任何二级结构。再折叠试验表明四个中间体可以转化为天然的HPI，并且P1，P3和P4都要重排为含有A20-B19天然二硫键的P2才能转化为天然的HPI。对中间体的时间分布，二硫键配对方式和再折叠途径的分析可以推测出HPI的体外折叠途径：再折叠的初期，还原的HPI上的自由巯基随机碰撞形成含有三个二硫键的中间体，随后二级结构的形成促使并指导P1, P3, P4进行二硫键重排转化为含有天然二硫键A20-B19的P2，P2中进一步形成的二级结构又促使A6，A7，A11与B7之间的二硫键重排直到形成天然二硫键B7-A7和A6-A11。通过比较HPI和PIP的折叠途径可以发现两者的折叠机制既有不同点又有相似之处。相似之处在于，HPI和PIP的氧化折叠的过程中B链中部(螺旋的形成都是最早、最关键的一步，并且只有A20-B19形成以后两者才能逐步形成正确的二硫键配对和天然的构象，因此我们推测胰岛素的折叠起始点存在于B链中部的(螺旋，而A20-B19的形成是折叠信息由B链向A链顺利传递的保障。HPI和PIP折叠机制的不同反映了C肽在折叠中的作用。C肽的存在不但有利于HPI的折叠，而且也支配了HPI折叠的动力学途径。因此，尽管胰岛素的A链和B链包含了胰岛素折叠信息，但胰岛素完整的折叠信息存在于A链，B链和连接肽中。此外，也讨论了HPI的体外折叠对体内折叠的一些启示。 蛋白质解折叠的研究往往可以间接地帮助研究蛋白质的折叠机制，所以在第三章中我们用二硫键异构化的方法研究了人胰岛素原的解折叠。在变性剂和巯基试剂的存在下，含有二硫键的蛋白质被变性并进行二硫键重排，从而生成一系列含有非天然二硫键并能够被分离纯化的二硫键异构体，这种蛋白质变性的方法称