收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

大鼠核糖体RNA一个新的结构域以及辛纳毒蛋白A链缺失突变的研究

何文君  
【摘要】: 本论文包括三部分内容: 第一部分 裸子植物侧柏种子中一种RNA水解酶型核糖体失活蛋白(Orientin)的发现及其在大鼠核糖体RNA上作用位点的确定 核糖体失活蛋白是一类来自于细菌、真菌和高等植物的核毒素,它们通过作用于核糖体的大亚基28S RNA或23S RNA失活核糖体,从而抑制蛋白质的合成。本工作首次在裸子植物侧柏种子中发现一种新型的RNA水解酶活性的核糖体失活蛋白Orientin,它可以作用于大鼠核糖体RNA产生一个特异RNA条带。经过RNA酶法测序、引物延伸法测序、RT-PCR、两向薄层层析等方法,我们确定了Orientin是通过水解大鼠核糖体28S RNA第4451位胞苷与4452位腺苷之间的磷酸二酯键来影响核糖体的功能。Orientin在大鼠核糖体28S RNA上的作用位点所在的RNA序列在高等真核生物28S rRNA中保守性较强,推测该RNA区域参与真核核糖体催化肽链的延伸过程;同时Orientin的发现也为研究核糖体RNA中一个新的功能结构域提供了工具。大鼠核糖体28S RNA内一个磷酸二酯键的断裂造成核糖体功能的降低为支持核糖体中RNA是主要的功能分子提供了新的依据。 第二部分 核糖体失活蛋白Cinnamomin A链N端和C端区域缺失突变与酶活性关系的研究 辛纳毒蛋白(Cinnamomin)是一种来源于香樟树种子的II型核糖体失活蛋白,它的A链具有RNA N-糖苷酶活力,可以特异性水解大鼠核糖体28S RNA S/R茎环结构中A4324位的糖苷键,失活核糖体,使蛋白合成终止于肽链延伸步骤。辛纳毒蛋白A链还可以作用于超螺旋DNA分子,产生缺刻和线状DNA分子。本工作构建了辛纳毒蛋白A链的缺失突变体(D3、D5、D3-5和DC3-5),分别或同时缺失了A链C末端51个氨基酸残基、N末端52个氨基酸残基,其中突变体DC3-5是在突变体D3-5的C末端增加三个氨基酸:Ile、Cys、Arg,并在E.coli中以包涵体的形式高效表达了辛纳毒蛋白A链和它的四个缺失突变体。利用尿素变性、快速稀释法复性和DEAE-Sepharose柱层析,从纯化的包涵体中获得了一系列重组蛋白。通过蛋白质体外翻译抑制试验分析和RNA N-糖苷酶活力检测,发现与复性的重组野生型辛纳毒蛋白A链相比,四个缺失突变体都不具有明显的失活核糖体的RNA N-糖苷酶活力;同时发现缺失突变体也丧失了作用于超螺旋DNA分子,产生缺刻和线状DNA分子的活性。说明辛纳毒蛋白A链的C末端51个氨基酸残基和N末端52个氨基酸残基是维持该蛋白酶活性所必需。进一步检测发现,天然和 WP=4 重组辛纳毒蛋白A链都可以在超螺旋DNA分子上产生多个脱腺嘌呤位点。推测辛纳毒蛋白A链之所以可以作用于超螺旋DNA分子,产生缺刻和线状DNA分子是由于在DNA分子上脱腺嘌呤的结果,而不是外源核酸酶污染或辛纳毒蛋白A链另外具备的超螺旋DNA分子依赖的DNase的缘故。 第三部分 酸性条件下核糖体失活蛋白Gelonin对于Sarcin/Ricin结构域RNA(SRD RNA)非特异性脱腺嘌呤的研究 I型核糖体失活蛋白Gelonin,可以特异性水解大鼠核糖体28S RNA S/R结构域中A4324的糖苷键,不可逆抑制核糖体催化的蛋白质合成。但是近来发现Gelonin可以水解已除去蛋白质的核糖体RNA和DNA分子上的糖苷键,释放腺嘌呤碱基,关于Gelonin的底物位点专一性是否改变及如何改变尚不清楚。本文利用体外合成的大鼠核糖体28S RNA Sarcin/Ricin结构域的小分子模拟物SRD RNA及其突变体为底物,研究反应体系中pH的变化对Gelonin催化脱腺嘌呤反应特异性的影响,发现在酸性条件下Gelonin可以催化SRD RNA及其突变体(包括置换突变体UUUU和缺失突变体G(GA)上非特异性脱腺嘌呤反应的发生;同时,Gelonin还可以催化不具备二级结构的poly(A)分子上的脱腺嘌呤反应,其活力随着pH值的降低而增强。通过不同pH条件下的圆二色分析发现Gelonin蛋白自身的构象并未发生明显的变化。推测酸性反应条件可能影响底物RNA分子的高级结构或质子化程度,导致非特异性脱嘌呤反应的发生。中性条件下Gelonin特异性水解核糖体28S RNA S/R结构域中A4324的糖苷键可能是由于S/R结构域特定的空间结构使A4324的糖苷键恰巧暴露于Gelonin的活性中心。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 李向东,刘望夷;核糖体失活蛋白及核糖体拓扑结构的研究进展[J];生命的化学;1997年02期
2 侯法健,刘仁水,刘望夷;新丰毒蛋白——一种新的具有活性小A链的核糖体失活蛋白(英文)[J];生物化学与生物物理进展;2002年04期
3 刘望夷;张劲松;刘仁水;何文君;凌俊;;核糖体失活蛋白及核糖体RNA结构与功能的研究[J];中国科技奖励;2006年10期
4 魏明卉,李英,刘征;核糖体失活蛋白及研究进展[J];南都学坛;2001年06期
5 程雪,胡进耀,苏智先;丝瓜核糖体失活蛋白的研究进展综述[J];西华师范大学学报(自然科学版);2004年02期
6 王润华,郑硕,沈倍奋;括楼素的纯化及其免疫毒素的制备[J];中国生物化学与分子生物学报;1993年05期
7 李向东,刘望夷;核糖体失活蛋白及核糖体拓扑结构的研究进展(续完)[J];生命的化学;1997年03期
8 孙海燕,胡家恕,汪俏梅;苦瓜的核糖体失活蛋白[J];细胞生物学杂志;2004年03期
9 凌俊;刘望夷;王德宝;;核糖体被RNA N-糖苷酶失活以后的活力恢复[J];科学通报;1993年24期
10 孙亚卿;邵金旺;张少英;;植物的核糖体失活蛋白及其应用[J];植物生理学通讯;2007年05期
11 孟延发,孟雪琴,张雪梅,杜毅峰,李春阳,阳燕,徐柳,刘波,魏旭文;苦瓜籽核糖体失活蛋白的基本性质研究[J];兰州大学学报(自然科学版);2000年04期
12 蒋荣庆,娄艳春,刘望夷;樟树种子核糖体失活蛋白的初步研究[J];生物化学与生物物理进展;1990年02期
13 裴武红,王润华,郑硕,沈倍奋;重组蓖麻毒素A链与几种天然单链核糖体失活蛋白的活性研究[J];中国生物化学与分子生物学报;1999年01期
14 傅明辉,田洁;苦瓜籽核糖体失活蛋白的分离纯化及抗氧化活性的研究[J];中国生化药物杂志;2002年03期
15 陈毓荃,吕志强,吴伸;栝楼籽核糖体失活蛋白的纯化及性质研究[J];西北农业学报;1999年02期
16 林毅,林奇英,谢联辉;绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达[J];分子植物育种;2003年Z1期
17 林毅,谢荔岩,陈国强,吴祖建,谢联辉,林奇英;绞股蓝核糖体失活蛋白家族编码基因的5个cDNA及其下游非编码区[J];植物学通报;2005年02期
18 张劲松,刘望夷;天花粉蛋白的作用机制——RNA N-糖苷酶型[J];生物化学与生物物理进展;1991年01期
19 李文利,范琦,高晓蓉,迟彦,安利佳;β-1,3葡聚糖酶与糖体失活蛋白融合基因的制备及表达载体的构建[J];生物技术;2001年03期
20 林毅,陈国强,吴祖建,谢联辉,林奇英;C-末端缺失和完整的绞股蓝核糖体失活蛋白在大肠杆菌中的表达[J];江西农业大学学报(自然科学版);2004年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 陈明晃;谢捷明;王梓壬;;南瓜核糖体失活蛋白的生物学活性及其结构[A];中国毒理学会第四届全国学术会议论文(摘要)集[C];2005年
2 侯法建;刘望夷;;一种具有残缺A-链的辛纳毒蛋白的研究[A];中国毒理学会生物毒素毒理专业委员会第4次、中国生物化学与分子生物学会毒素专业组第5次学术研讨会论文摘要[C];2001年
3 侯法建;刘望夷;;一种具有残缺A-链的辛纳毒蛋白的研究[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
4 宋婀莉;田瑞;马素参;高友鹤;;PDZ结构域低丰度配体的筛选方法[A];中国蛋白质组学第三届学术大会论文摘要[C];2005年
5 单璐;童宇峰;冯银钢;王金凤;;金黄色葡萄球菌核酸酶无脯氨酸突变体的溶液结构及骨架动态特性研究[A];第十三届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];2004年
6 于长清;沈楠;周建华;;宿主天然抗逆转录病毒蛋白TRIM5α研究进展[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
7 赵明炜;王恩多;;亮氨酰-tRNA合成酶CP1结构域对于种属间tRNA~(Leu)的识别至关重要[A];第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集[C];2004年
8 傅成波;杜延顺;黄秉仁;谢云飞;苑玉和;白氡;崔迎彬;;TRAF6与RanBPM相互作用的研究[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年
9 于冰;缪泽鸿;蒋轶;李美红;杨娜;李婷;丁健;;c-Jun的非转录功能:与ODD结构域结合地阻断缺氧诱导因子HIF-1泛素化降解[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年
10 刘慧萍;柴玉波;陈苏民;王志珍;;蛋白质二硫键异构酶结构域的克隆与活性研究[A];生命科学与生物技术:中国科协第三届青年学术年会论文集[C];1998年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 何文君;大鼠核糖体RNA一个新的结构域以及辛纳毒蛋白A链缺失突变的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2002年
2 刘仁水;几种核糖体失活蛋白的分离纯化、性质、生理功能及分布的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2002年
3 吴益民;三个含SCAN结构域的锌指蛋白基因ZNF191、ZNF396和ZNF397研究[D];复旦大学;2002年
4 何华伟;肌酸激酶结构域相互作用与活性中心极性微环境的研究[D];清华大学;2007年
5 李睿;NBS1缺失突变导致小颅畸形的分子机制研究[D];北京协和医学院;2012年
6 周晓丽;蛋白质结构域重组构建新功能酶[D];吉林大学;2012年
7 汪宝忠;辛纳毒蛋白细胞毒性及热稳定性研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2003年
8 刘奕彤;Ccd1激活Wnt信号通路的分子机制[D];清华大学;2010年
9 吴勃;人源蛋白Vav2和Arap3的结构与功能研究[D];中国科学技术大学;2010年
10 毛大庆;野油菜黄单胞菌感光相关基因功能研究[D];清华大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 魏国清;植物核糖体失活蛋白对家蚕的毒杀作用及其机理的研究[D];安徽农业大学;2002年
2 杨海燕;新丰毒蛋白和辛纳毒蛋白凝集素亚基的结构和功能比较研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
3 王涛;辛纳毒蛋白的提纯,结晶以及结构分析Lcn6蛋白及其衍生物的表达,复性及结晶[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2007年
4 李丽;STGC3基因缺失突变对CNE2细胞生长增殖的影响[D];南华大学;2011年
5 陈岗;IRTKS蛋白的磷酸化修饰及降解的研究[D];华东理工大学;2011年
6 徐军;侧链氢键对嗜热酯酶APE1547及其推进器结构域稳定性的影响[D];吉林大学;2011年
7 奚慎立;含PH结构域蛋白CKIP-1的亚细胞定位机制研究[D];北京协和医学院;2008年
8 梁琳;颗粒裂解肽抗菌结构域的重组表达和生物活性分析[D];安徽大学;2011年
9 王伟;高温纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及其基因克隆和酶学性质研究[D];山东大学;2011年
10 夏思思;海洋放线菌氨基酸腺苷化结构域的克隆、表达和酶活性测定[D];华中师范大学;2012年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 医学院;颜宁研究组在《自然》发文[N];新清华;2011年
2 本报记者 宦建新通讯员 王利月;陈剑平:与“农”字相连与“科”字为伴[N];科技日报;2007年
3 吴一福;四军医大首次发现人脑抑癌新基因[N];中国医药报;2005年
4 顾春;陈剑平 只想为农民多做贡献[N];人民日报;2007年
5 记者 彭德倩;我科学家发现谷类“大个子”基因[N];解放日报;2006年
6 白毅;我国重大疾病相关基因及蛋白功能转化研究获进展[N];中国医药报;2008年
7 胡 文;科学让“巫术”成真(上)[N];河北日报;2002年
8 邹承鲁;科学研究五十年的点滴体会[N];科技日报;2002年
9 记者 项铮;单抗可能成为靶向性强的肿瘤药物[N];科技日报;2005年
10 杨玉良;从肥皂泡到生命过程[N];文汇报;2004年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978