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蓝藻NAD(P)H脱氢酶复合体的结构与生理功能研究

邓勇  
【摘要】:一般认为,蓝藻和高等植物类囊体膜上都存在 4 种膜蛋白复合体,即 PSII 复合体,细胞色素 b6/f 复合体,PSI 复合体和 ATP 合酶复合体。近年来,在蓝 藻、高等植物等的类囊体膜上又发现了另一类膜蛋白复合体,称为 NAD(P)H 脱 氢酶复合体(NDH),它是一类与线粒体复合体 I 高度同源的多亚基复合体。此 复合体在蓝藻中参与呼吸和光合循环电子传递,在高等植物中参与光合循环电 子传递和叶绿体呼吸等过程。越来越多的证据表明,NDH 对蓝藻的生理活动甚 至生存起着重要的作用,因而对蓝藻 NDH 的结构与生理功能的研究正日益受 到重视。然而,目前蓝藻 NDH 复合体的结构与功能研究仍处于起步阶段。本 文的研究工作主要集中于 NDH 在蓝藻对低 CO2浓度的响应和适应中的作用、 NDH 复合体的分离纯化以及其与藻胆蛋白的相互作用等方面。 1.低 CO2 浓度对集胞蓝藻 NDH 复合体的影响 比较了高 CO2(H-cells)和低 CO2(L-cells)下培养的集胞蓝藻 PCC6803 中 NAD(P)H 脱氢酶复合体(NDH)的活性以及亚基表达。Western 印迹分析表 明,L-cells 所含的 NDH 亚基,NdhH、NdhI 和 NdhK 的量明显比 H-cells 高。 非变性凝胶电泳以及活性染色分析显示,L-cells 中,NADPH 专一的 NDH 亚复 合体具有更高的 NADPH-氮蓝四唑(NBT)氧化还原酶活性;此外,L-cells 中, NADPH-menadione 氧化还原酶和光系统 I(PSI)驱动的 NADPH 氧化活性也明 显比 H-cells 高,这都表明 NDH 的活性在低 CO2下增强了。在 DCMU 和背景 远红光存在下,测得的作用光关闭后 P700+的暗中还原初始速率在 L-cells 中明 显提高,表明 L-cells 中围绕 PSI 的循环电子传递增强。NDH 的专一抑制剂, 鱼藤酮(rotenone)对 L-cells 的作用光关闭后叶绿素荧光瞬时上升的抑制程度 比 H-cells 要大得多,这说明在低 CO2浓度下 NDH 介导的循环电子传递明显加 强。以上结果表明,NDH 及其介导的循环电子传递均为低 CO2促进,提示 NDH IV WP=6 参与蓝藻对低 CO2的适应过程。 2.集胞蓝藻中 NDH 复合体对 CO2 浓度变化的响应 通过非变性凝胶电泳分离和活性染色,从集胞蓝藻 PCC6803 的细胞粗提 物中检测到一个 NADPH 专一的 NDH 亚复合体。当高 CO2浓度培养的蓝藻细 胞转为低 CO2浓度培养时,此 NDH 亚复合体的活性迅速提高,同时伴随 NdhK 亚基蛋白质表达水平和 PSI 驱动的 NADPH 氧化活性明显增加。而当低 CO2浓 度培养的蓝藻转为高 CO2浓度培养时,一开始,此 NDH 亚复合体和 PSI 驱动 的 NADPH 氧化活性以及 NdhK 的蛋白质表达水平均有轻微的提高,但随着培 养时间的增加,都有不同程度的明显下降。这些结果表明体外的 CO2浓度作为 信号可调控 NDH 复合体的活性,同时 NDH 复合体反过来也可参与 CO2吸收的 调节。 驱动的 NADPH 氧化活性可以反映 NDH 介导的循环电子传递的活性, PSI 因此我们的结果也表明 NDH 介导的 PSI 循环电子传递活性受低 CO2诱导而为 高 CO2抑制。综合以上结果,说明 NDH 及其介导的循环电子传递可能参与蓝 藻对 CO2浓度变化的响应。 3.集胞蓝藻 PCC6803 含疏水亚基的 NAD(P)H 脱氢酶亚复合体的分离 蓝藻 NDH 复合体的分离纯化比较困难。迄今,人们只分离到几个 NDH 亲 水亚复合体,含疏水亚基的蓝藻 NDH 亚复合体的分离还未见报道。我们利用 离子交换与凝胶过滤层析,从 n-dodecyl β-D-maltoside (DM)处理的集胞蓝藻 Synechocystis PCC6803 细胞粗提液中,首次分离到两个包含 NDH 疏水亚基 NdhA 的亚复合体。酶活分析表明,分离到的 NDH 亚复合体具有 NADPH-氮蓝 四唑(NBT)氧化还原酶活性,以 NADPH 为电子供体可以还原铁氰化钾、二溴百 里香醌(DBMIB)、二氯酚靛酚(DCPIP)、duroquinone 以及 UQ-0 等质醌类电 子受体。 4.集胞蓝藻 PCC6803 中 NAD(P)H 脱氢酶与藻胆蛋白结合的初步证据 通过非变性凝胶电泳(native-PAGE)和 NADPH-氮蓝四唑(NBT)氧化还 原酶活性染色,从集胞蓝藻 PCC6803 的细胞粗提物中检测到一个 NADPH 专一 的 NAD(P)H 脱氢酶(NDH)亚复合体,Western 印迹分析表明此亚复合体含 V WP=7 NdhA、NdhB 和 NdhH 但不含 NdhK 和 Fd-NADP+氧化还原酶(FNR)。吸收光 谱和 77K 荧光光谱显示此亚复合体中含别藻蓝蛋白和藻蓝蛋白。进一步利用离 子交换与凝胶过滤层析从细胞粗提物中分离 NDH 时,发现 NADPH-铁氰化钾 氧化还原酶和NADPH-NBT氧化还原酶活性总是与藻胆蛋白共分离,无法分开。 分离得到的NDH经 native-PAGE 分离和活性染色后,在凝胶上检测到两条 NDH 活性条带,Western 印迹分析显示此两条带均含 NDH 的亚基,表明它们都是 NDH 亚复合体。此两 NDH 条带在活性染色前均为蓝色,在非变性条件下将其 蛋白质溶出后,吸收光谱以及 77K 和室温荧光光谱均显示此两条带含有藻胆蛋 白。本文的结果表明,至少在我们的实验条件下,集胞蓝藻 PCC6803 中 NDH 复合体与藻胆蛋白相互结合。


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