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破骨细胞形成抑制因子OPG、蝎毒素BmK ITa1的基因克隆、表达及其功能研究

刘珍  
【摘要】: 本论文利用RT-PCR和RACE技术克隆了OPG和BmK ITa1两个基因, 并分别对其进行了表达及功能研究。 第一部分,OPG及其突变体OPG-280、OPG-Fc的构建、表达及功能研究。 破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor, OCIF 或称 osteoprotegerin, OPG) 是1997年发现的具有降血钙作用和防止骨质流失的一种新的可以调节骨密度的糖蛋白质。OPG作为一种新发现的蛋白质,具有很高的研究意义和开发价值。目前用于结构与功能研究的OPG主要通过CHO细胞表达重组蛋白, 但其较低的表达量限制了研究进程。所以我们的目标就是利用基因工程手段构建一系列OPG突变体,同时完成将它们在不同的表达系统中进行重组表达的研究以建立一种或几种理想的表达系统用以大量制备具有生物活性的重组蛋白。 成熟的OPG共有380个氨基酸,存在着单体和二聚体两种形式,其中Cys379对OPG形成同源二聚体是必需的。之前,我们利用RT-PCR技术首次从中国人正常肝细胞株L02中克隆到一种新的破骨细胞形成抑制因子变体基因(OPG-372) (GenBank登录号AF134187), 序列分析结果表明,与国外文献报道相比较,中国人肝细胞株和胎盘中该cDNA 3'端存在一个赭石型终止码突变,从而使这一个蛋白比报道的在C端少8个氨基酸残基。 OPG-372基因已在昆虫杆状病毒表达系统表达并证明OPG-372没有形成二聚体。 为了构建OPG一系列突变体,进一步比较重组OPG单体与同源二聚体的体内代谢及其生物效应稳定性, 我们接着从中国人外周血淋巴细胞(PBL)中克隆了OPG基因3’端基因组序列210bp,与国外文献报道的OPG cDNA3'序列相一致,将此210bp与OPG-372重组拼接得到全长无缺失的OPG。 同时,考虑到人免疫球蛋白IgG Fc片段的多个二硫键可能有助于OPG形成同源二聚体, 我们在OPG-372 C端融合Fc得到加长突变体OPG-Fc。 另外,为了调查重组OPG最小的功能片段,结合其结构特点,我们去除OPG-372 C端的100个氨基酸,得到缩短突变体OPG-280。 WP=3 之后,本论文首次成功地将OPG及其变体OPG-280和OPG-Fc基因克隆于表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中进行融合表达。研究结果表明经1mmol/L IPTG诱导5h后,OPG-280得到高效表达,产物主要为不溶性包涵体,OPG, OPG-Fc 仅有少量表达。将OPG-280 经Ni2+-IDA柱纯化,变复性,OPG-280的6×His 融合蛋白在3h后可以降低小鼠血钙浓度1.5 mg/100ml, 即下降15%左右。然而,OPG和OPG-Fc在大肠杆菌中的重组表达量太低, Ni2+-IDA柱亲和层析纯化后表达产物很少,而且需要对表达产物进行变复性,不足进行动物实验。所以我们在其他表达系统如昆虫表达体系进行OPG进一步研究。 进而,将OPG、OPG-280和OPG-Fc基因分别插入昆虫杆状病毒供体质粒pFastBac1和pFastBacHTb中, 成功地将OPG、OPG-280、OPG-Fc三种基因在粉纹夜蛾Tn-5B1-4细胞中得到高效表达,而且OPG-Fc在Tn细胞中形成同源二聚体。经小鼠降血钙实验发现,六种表达产物OPG 、OPG-280、OPG-Fc 、His-OPG 、His-OPG-280、 His-OPG-Fc均有生物活性,它们3h后可以降低小鼠血钙浓度分别为10%,11%,15%,8%,10%,14%。 同时,我们首次将OPG、OPG-280和OPG-Fc基因克隆于昆虫病毒转移载体pBacPAK8 中,并将它们在家蚕核型多角体病毒(BmNPV)-家蚕( Bombyx mori)表达系统中进行了高效表达,通过非还原SDS-PAGE 发现OPG和OPG-Fc均能形成同源二聚体,而且表达的OPG蛋白出现糖基化。通过小鼠降血钙的实验,证明了三种重组表达产物OPG、OPG-280、OPG-Fc均有良好的生物活性,它们3h后可以降低小鼠血钙浓度分别为19%,14%,17%。 在以上三个表达系统中,C端缺失100个氨基酸的OPG-280仅以单体方式存在, OPG仅在昆虫虫体中可以形成二聚体,C端融合人免疫球蛋白Fc片段的OPG-Fc在大肠杆菌中没有形成同源二聚体,而在Tn细胞和家蚕虫体内均存在单体和同源二聚体两种形式,推测Fc自身的多个二硫键有助于OPG同源二聚体的形成。从小鼠降血钙实验分析,在昆虫细胞产物中,OPG-Fc活性最高,在昆虫虫体中,OPG和OPG-Fc活性相当,说明在虫体中都能很好形成稳定双体,活力略高于单体,而C端缺失100个氨基酸对其生物学活性没有明显影响。这为开发重组表达OPG的家蚕口服药物在临床上治疗高血钙症以及骨质疏松症等疾病创造了条件。 第二部分,蝎毒素基因BmK ITa1的克隆、表达及其重组蛋白酰胺化后加工 WP=4 的研究。 根据东亚钳蝎中的抑制型昆虫毒素的N端序列,戚正武先生实验室利用cDNA末端序列快速扩增技术 (RACE) 从蝎尾腺总RNA中克隆到多个昆虫毒素cDNA,我们从中得到一个BmK ITa1 cDNA,经测序证明它是抑制型昆虫型毒素。它的结构与已知的抑制型昆虫型毒素很相似:cDNA 编码一段21个残基的信号肽,一段61个残基的成熟肽和C末端三个额外的残基,而且序列也很同源。在BmK ITa1 cDNA 的成熟肽编码区后有GKK 三个残基,这说明BmK ITa1 的基因产物C末端是酰胺化的。(GenBank登录号AY090782) 接着,我们将BmK ITa1基因克隆至装有融合蛋白DsbC的表达载体pET-40b中,得到融合基因DsbC-BmK ITa1在大肠杆菌中重组表达。经1mM的IPTG诱导表达3小时,超声破菌后表达产物约占细菌蛋白质总量


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