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β-内酰胺抗生素酰化酶产生菌Flavobactrium sp.650的研究

朱颂成  
【摘要】: β-内酰胺抗生素酰化酶包括青霉素酰化酶和头孢菌素酰化酶,它们分别水解青霉素和头孢菌素,生成相应β-内酰胺母核和侧链,这二种酶都已经分别用于β-内酰胺母核6-APA和7-ACA的工业生产。因此,β-内酰胺抗生素酰化酶在抗生素的工业生产上占有十分重要的地位。本论文系统地研究了头孢菌素酰化酶产生菌的筛选方法并筛选到一株菌,可以产生多种β-内酰胺抗生素酰化酶。克隆了其中二个酰化酶的基因并研究了它们的性质。 1 头孢菌素酰化酶产生菌筛选系统的建立及菌株筛选 根据头孢菌素酰化酶主要识别头孢菌素侧链的特性,建立了二种头孢菌素酰化酶产生菌的筛选系统。一种系统采用一系列生色的头孢菌素酰化酶底物类似物为筛选物质,可以从大量的菌株中快速的检定出酰化酶产生菌。另一种系统中,设计并合成了一系列由头孢菌素的侧链和青霉素G 的母核6-APA组成的“杂合”抗生素,用这类杂合抗生素为底物,以一株对6-APA敏感但抗青霉素G的菌株Serratia marcescens为指示菌,建立了微生物学的头孢菌素酰化酶产生菌筛选和鉴定方法。该方法灵敏,专一,高通量。由于底物容易合成,指示菌已经商品化,因此该方法为头孢菌素酰化酶产生菌的筛选提供了一个高通量的筛选平台。 利用已建立的方法筛选到一株菌Flavobacterium sp.650, 可以产生头孢菌素C酰化酶,青霉素G酰化酶和5-己二酰胺-2-硝基苯甲酸酰化酶。 2 Flavobactrium sp.650青霉素G酰化酶的研究 从Flavobactrium sp.650基因组文库中克隆了该菌的青霉素G酰化酶基因,研究了该基因的一些表达调控特性和酶学性质。Flavobactrium sp.650青霉素G酰化酶基因为2589bp, G+C 含量为68.64%,编码862个氨基酸,和其他来源的 WP=5 青霉素G酰化酶同源性最高的为53%,是一种新型的青霉素G酰化酶。该青霉素G酰化酶由大小分别为62kD和22kD二个亚基组成。该酶 对NIPAB和青霉素 G的 Km 分别为 2.7×10-5 M 和 8.9×10-6M, 对二者的 kcat 分别为 68.84 s-1 和72.69 s-1,高于其他大多数的青霉素G酰化酶。该酶酶活被PMSF 强烈抑制,Ki 值为 0.1μM。酶活也被头孢菌素酰化酶的抑制剂bromoacetyl-7-ACA所抑制,Ki为 2.3mM。该青霉素G酰化酶合成活力为0.8U/mg pr.,合成活力与水解活力的比为1/60,略高于大肠杆菌青霉素G酰化酶(1/80)。酶活的最适温度为 600C,最适pH为8.0。 与其它大多数的青霉素G酰化酶基因的表达需要苯乙酸的诱导不同,该青霉素G酰化酶基因在大肠杆菌中的表达是组成型的,培养基中加入苯乙酸不仅没有诱导作用,而且还会对基因的表达产生抑制作用。该基因的表达受到温度的调控,370C 培养导致低酶活,最适合基因表达的温度为280C, 高于其它青霉素G酰化酶基因(22-250C)。该青霉素G酰化酶的性状表明它要优于大肠杆菌青霉素G酰化酶,更适合于工业生产。 3 Flavobacterium sp.650 5-己二酰胺-2-硝基苯甲酸酰化酶研究 Flavobacterium sp.650的5-己二酰胺-2-硝基苯甲酸酰化酶能够水解头孢菌素和多个头孢菌素类似物,尤其是能够水解含己二酸侧链的类似物。5-己二酰胺-2-硝基-5苯甲酸酰化酶基因为1530bp, G+C 含量为71%,编码509个氨基酸。它是一种新型的酰化酶,和来源于真核和原核的酰化酶在进化上有相关性,其中和细菌的尼龙聚合物降解酶E1(6-aminohexanoate-cyclic-dimer hydrolase (EC 3.5.2.12))以及 Mycobacterium tuberculosis 中推测的酰化酶家族中的amiC有一定的同源性,分别为36%和29%。纯化了5-己二酰胺-2-硝基苯甲酸酰化酶并测定了它的N端氨基酸,它是一个分子量为53KD单亚基,N端氨基酸RVDSSSFDAM,而由它的基因序列推测的N端氨基酸为MGTADRVDSSSFDAM,因此该酶可能存在翻译后加工的现象。该酰化酶对GL-7ACA和CPC的 比活力分别为2 u/mg pr.和0.5u/mg pr.。对5-己二酰胺-2- WP=6 硝基苯甲酸的Km比对5-戊二酰胺-2-硝基苯甲酸的Km 小,分别为0.315mM 和 0.958mM,因此该酶对六碳的侧链的亲和力要大于对五碳的亲和力,有可能将其进一步改造成为对头孢菌素C具有较高活力的酶。由于它和来源于细菌的尼龙聚合物降解酶E1具有一定的同源性,因此也有可能用于工业上某些相关的领域。


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