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农杆菌介导的玉米优良自交系遗传转化研究及成熟胚再生系统的建立

黄雪清  
【摘要】:玉米是重要的粮食作物和饲料作物,建立农杆菌介导的优良玉米自交系的遗传转 化体系,对玉米基因工程育种具有十分重大的意义。本研究以 4 个玉米优良自交系 9046,齐 319,414,Mo17 的幼胚为材料,详细研究了影响农杆菌介导玉米转化的各 种因素,建立了优良自交系的遗传转化体系。研究结果表明,1.0-2.0 mm 的幼胚 是最适宜的转化受体;超毒力菌株EHA105比LBA4404和GV3101具有更强的侵染力; 在感染液和共培养基中都加入乙酰丁香酮(200μmol/L)和抗坏血酸(50mg/L),在 感染液中添加表面活性剂(0.1% Tween20),能显著提高转化效率;合适的菌液浓度 (OD600=0.8) 染时间(20 min)、共培养时间(3 d)、较低共培养温度(22℃) 、浸 、 较酸的共培养基(pH5.4)均有利于提高T-DNA转移效率。感染前将幼胚高渗透压预 处理未能提高转化率;延迟筛选有利于提高抗性愈伤组织的存活率和分化率。应用这 个转化体系,获得了供试的4个自交系的42株转基因植株,PCR阳性植株率为2.35 %-5.26%。分子检测表明,T-DNA 上的外源基因已经稳定整合进了玉米基因组并 得到表达。转基因植株后代(T1代)的遗传分析表明,外源基因在后代中呈孟德尔遗 传分离。这一体系的建立,为进一步将有用基因导入玉米优良自交系奠定了基础。 幼胚是目前遗传转化中应用最多的外植体,然而,幼胚作为外植体,取材受到地 理条件、季节和发育阶段的严格限制。相比之下,成熟胚取材方便,不受时间和数量 的限制,是一种较理想的再生体系。然而,成熟胚被认为是更玩拗,难于再生的外植 体。本研究以7个玉米优良自交系为材料,研究了影响成熟胚再生的各种因素,建立 了成熟胚高频植株再生体系。研究表明,高浓度的 2,4-D(4.0 mg/L)是诱导愈伤组 织必须的;在继代培养基中添加适量的2,4-D(2.0mg/L),BA(0.2mg/L)和硝酸银 (10 mg/L)显著增加胚性愈伤组织的形成;在分化培养基中添加0.5 mg/L BA有利 于提高发愈伤组织分化频率。应用这个再生体系,7个自交系的成熟胚均得到再生植 株,频率为19.8-32.4%。这个体系的建立,为进一步建立以成熟胚为受体系统的遗 传转化体系奠定了基础。


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