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鲫鱼视网膜神经节细胞上的γ-氨基丁酸和甘氨酸受体

李耕林  
【摘要】:多年来的研究表明,视网膜神经节细胞(RGC)接受来自无长突细胞(AC)和/ 或网间细胞(IPC)的 γ-氨基丁酸(GABA)能或甘氨酸(GLY)能的抑制性输入,并 且这些输入参与了 RGC 感受野形成等许多重要功能的实现。我们应用荧光逆 行追踪技术来识别酶解分离后的鲫鱼 RGC,并运用全细胞膜片钳记录技术,结 合快速溶液切换装置(RSC-100),较系统地研究了这些神经元上 GABA 和 GLY 受体的特性,以及锌离子(Zn2+)对这两种受体所介导反应的调制。 分离的 RGC 具有正常的电生理特性,部分(10/24)分离的鲫鱼 RGC 显示自 发的 AP。在全细胞电流钳记录模式下,有些是随机的发放(n = 5),有些按一定 频率(~10 Hz)发放(n = 3),有些则成串发放(n = 2)。当注入不同强度的电流时, 在所有逆行追踪识别出的 RGC (n = 24)都能诱导出 AP 的发放。多数 RGC呈时 相型 AP 诱导发放 (n = 18),即只在去极化的初始一段时间内发放;且注入电流 强度越大,其发放 AP 的时程越短。在部分 RGC 上,不论注入多大强度的电流 都只在去极化初始时发放一个 AP(n = 4)。而少数 RGC 在整个去极化时期内都 发放 AP,且发放的频率与所注入电流的强度呈线性关系(n = 2)。 在几乎所有的鲫鱼 RGC 上,100 μM GABA 都能诱导出 1~3 nA 的内向电 流。这种电流反应在快速到达反应最大值后会衰减到一个持续的状态,表明介 导该反应的 GABA 受体能快速失敏(Desensitization),其失敏的过程可以用单指 数方程很好的拟合,得到的时间常数(τ)为 1.35 ± 0.17 s (n = 14)。这种电流反应 ---3 --- WP=7 中文摘要 能被同时施加的 100 μM 荷包牡丹碱(BIC)所完全阻断(n = 5),提示该反应完全 是由 GABAA 受体所介导。应用非静态方差分析(NSVA),我们估算出这种 GABAA 受体的单通道电导为~10 pS。通过施加不同浓度的 GABA 我们拟合出 GABA 的剂量-反应曲线,得到的 EC50为 25.2 ± 0.17 μM,相应的 Hill 系数为 1.64 ± 0.02 (n = 5)。我们还分析了 Zn2+对 GABA 反应的调制。Zn2+对 GABA 反 应有浓度依赖性的压抑作用:10 μM Zn2+将 100 μM GABA所诱导的电流反应减 小到对照水平的 64.5 ± 12.1% (n = 6),而 100 μM Zn2+能将该反应进一步减小到 对照水平的 34.3 ± 13.2% (n = 6)。对于 30 μM GABA 所诱导的电流反应也观察 到类似的浓度依赖性压抑作用。 在大部分鲫鱼 RGC 上(82/93),100 μM GLY 能诱导出~1 nA 的内向电流反 应。同 GABA 反应相类似,该电流反应也表现出明显的失敏,其失敏的时程也 可以用单指数方程很好的拟合,得到的时间常数(τ)为 1.65 ± 0.22 s (n = 36)。经 预先孵育,1 μM 士的宁(STR)能完全阻断 100 μM GLY 所诱导的电流反应(n = 7),提示该电流反应完全由 STR 敏感的 GLY 受体所介导。应用非静态方差分 析(NSVA),这种受体的单通道电导被估算为~3 pS。施加不同浓度的 GLY,并 拟合 GLY的剂量-反应曲线,得到 GLY的 EC50和 Hill系数分为 44.5 ± 2.2 μM 和 1.64 ± 0.02 (n = 5)。 我们进一步细致地分析了 GLY 受体拮抗剂的作用。首先,记录了在不同 浓度 STR 存在下的 100 μM GLY 所诱导的电流反应,并拟合出 STR 的 IC50和 Hill 系数分别为 37.2 ± 3.4 nM 和 0.88 ± 0.08。值得注意的是,随着 STR 浓度的 升高,GLY 反应前期的快速衰减部分被强烈压抑,直至在 200 nM STR 存在时 ---4 --- WP=8 中文摘要 GLY 反应只剩下一个缓慢上升并持续的电流成分。但频谱分析的结果提示这个 持续电流成分与对照反应可能由同一类 GLY受体所介导。 在 200 nM STR存在时 GLY反应的缓慢上升,一种可能的解释是由于竞争 性拮抗剂 STR的缓慢解离。为检验这种可能性,我们记录 100 μM GLY所诱导 的电流反应在用 1 μM STR 阻断后恢复的时程来研究 STR 从 GLY 受体上解离 的过程。结果显示,GLY 反应恢复非常缓慢,其过程可以用单指数方程很好地 拟合,其时间常数(τ)为 4~5 s。这一结果表明,相对于 GLY的快速解离过程(在 200 ms 以内),STR 从 GLY 受体上解离下来很缓慢。因此,在 200 nM STR 存 在时,GLY 不能及时而充分地与 GLY 受体结合;但随着时间的延长,STR 的 解离和 GLY 的结合逐渐达到一个新的平衡,从而表现出一个缓慢上升而持续 的电流反应。 同时我们还注意到,当 1 μM STR 与 GLY 同时施加时,GLY 会诱导出一 个衰减极快的内向电流(其衰减可用单指数方程拟合,τ = ~0.4 s),而该反应的 最大值与对照 GLY反应很接近。这一结果提示 STR 与 GLY 受体的结合也很缓 慢,因此当同时施加 STR 和 GLY 时,由于 GLY 结合较快而诱导出电流,但却 由于 STR 的结合而很快被阻断;如果预先用 STR 孵育后,1 μM STR 可完全阻 断 GLY反应。 高浓度的二氯犬尿酸(DCKA)可以用作抑制性 GLY 受体的拮抗剂。低于 200 μM 的 DCKA 对 100 μM GLY 所诱导的电流反应没有显著影响,而 500 μM DCKA 只能部分地阻断该反应(减小到对照水平的 59.6 ± 5.1%,n = 9),但不改 变反应的时程。这一结果提示在鲫鱼 RGC 上不存在 DCKA 敏感的 GLY 受体, 而 500 μM D


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