寡肽（OGP、HIV-1 tat～[47-57]）的合成、聚合及功能研究以及NRSF/REST在转录调控方面的研究

【摘要】：本论文由两部分组成,第一部分是成骨生长肽(Osteogenic Growth Peptide, OGP)和 HIV-1 tat[47-57]的合成、聚合及功能研究;第二部分是神经细胞限制性 沉 默 因 子 ( Neuron restrictive silencer factor/repressor element-1 silencing transcription factor,NRSF/REST)在转录调控方面的研究。 第一部分第一章阐述了 OGP 的合成及在造血方面与人重组粒细胞集落刺 激因子(rhG-CSF)的协同作用。OGP 体外促进成骨细胞 MC3T3 E1 和成纤维 细胞 NIH 3T3 增殖,提高碱性磷酸酶活性,促进基质矿化;体内能够促进成骨 和造血。OGP 可以增加正常小鼠外周血白细胞和骨髓细胞数,提高放射性损伤 小鼠骨髓移植后的存活率;环磷酰胺造成的小鼠骨髓损伤给予OGP(10-15)( OGP 的 C 端 5 肽),可以加快小鼠外周血白细胞的恢复,并可以动员小鼠外周血干祖 细胞。本论文工作发现 OGP 能显著地协同 rhG-CSF 促进小鼠外周血白细胞数和 淋巴细胞数增加,说明 OGP 是一种可以增强目前临床上广泛使用的 rhG-CSF 功能的新的因子,是一种潜在的具有开发前景的新药。 免疫分析法是追踪生理活性多肽特性的一个必要工具。为了研究 OGP 的 特性,本论文第一部分第二章阐述了 OGP 的聚合、通过 OGP 聚合物制备其特 异性的抗体以及对 OGP 的免疫分析。含有分支或侧链的大分子化合物 (polyvalent dendrimers),在免疫、抗病毒、作为 DNA 和药物的载体等方面有 所应用。而被应用的含有多肽分支或侧链的化合物(peptide dendrimers)主要有两 种类型:一种是以多价化合物如多聚赖氨酸(pLL)为核心结构,通过表面的分 支单位偶联多条多肽链;另一种是多重抗原肽(MAP)系统,它只有分支单位 和偶联在上面的多肽链,没有核心结构。本章阐述了一种简单的方法制备多肽 聚合物(多聚分支肽):将含有双键的丙烯酰基偶联到多肽的 α-或 ε-氨基,通过 自由基引发得到多聚分支肽。对于无侧链氨基的人胰岛素原 C 肽,含有侧链氨 1 WP=3 基的 OGP,含有侧链氨基并且含有很多疏水性氨基酸的 penetratin,我们采用了 不同的策略制备并得到了相应的多聚分支肽(poly-C peptide, poly-OGP, poly-penetratin)。用 poly-C peptide,poly-OGP 来免疫新西兰大白兔能够得到相 应的抗体,并且能够应用于免疫分析。 有文章报道 peptide dendrimers 可以用于转基因研究,所以我们尝试将多聚 分支肽作为质粒 DNA 的载体。第一部分第三章阐述了多聚分支 HIV-1 tat[47-57] 的制备及其在转基因方面的研究。通过 Sephadex G 150 我们对多聚分支 tat (poly-tat)进行了分离纯化,结果发现不同大小的聚合物都能够用作质粒 DNA 运输的载体,转染效率和细胞毒性与聚合产物的大小具有相关性。 第二部分阐述了 NRSF/REST 被下调后细胞的基因表达变化以及细胞分化。 NRSF/REST 是一种基因转录的负调控因子,在非神经类细胞中高表达,关闭了 神经类基因;在神经细胞中表达下降,相应的受其负调控的神经基因开放,暗 示 NRSF/REST 在胚胎发育中神经组织的发育,神经祖细胞分化起着重要作用。 本论文通过 SiRNA 下调 NRSF,通过 microarray 高通量地检测基因表达的变化, 并用 Real-time PCR 进行验证,发现了新的受到 NRSF/REST 调控的基因。结合 生物信息学,发现一些基因中含有 NRSF/REST 特异结合序列,即 NRSE 元件。 神经细胞特异性表达基因 Synapsin I 在非神经细胞中表达说明,NRSF/REST 对 非神经细胞向神经细胞的分化具有重要意义。用 RNAi 联合 microarray 来进行 转录调控的研究,为寻找转录因子新的靶基因提供了更加直接,有效和便利的 工具。