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水稻齿叶矮缩病毒的分子生物学研究及新城疫病毒检测新技术

邵朝纲  
【摘要】:本论文第一部分主要对水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRsv)的结构 蛋白(Pg)和非结构蛋白(Pns6,Pnslo)的功能进行了研究。 水稻齿叶矮缩病毒是分布于东南亚和我国南方地区引发水稻病毒病的一种植物呼 肠孤病毒,是植物呼肠孤病毒组第3亚组(稻属病毒)的病毒代表株系。RRSV是由媒 介昆虫水稻褐飞虱(Nilaparvata tugens)传播,它既可以在宿主水稻中繁殖,也能在媒 介昆虫体内繁殖。病毒结构上具有双层蛋白外壳,表面有刺突蛋白,具有10条dsRNA 基因组片段,属于双链RNA病毒。 (1)研究发现异源表达39kDa刺突蛋白的转基因水稻表现出很好的抗RRSV感染 的特性。而且,喂食该转基因水稻的褐飞虱,也获得了对RRSV的免疫,且免疫力正比 于转基因水稻中Pg蛋白的含量。这表明39kDa刺突蛋白干扰了完整病毒颗粒与昆虫细 胞受体之间的作用,它决定RRSV媒介昆虫的专一性。与目前通过杀灭媒介昆虫控制病 毒的方法相比,本研究提供了一种更环保和更持续的病毒控制方法。 (2)RRSV 56基因片段编码非结构蛋白Pns6,具有非特异性的核酸结合活性,与 单链核酸有更高的亲和力。通过Pns6:ssRNA复合物的稳定性实验,我们发现25OmM以 内的NaCI不影响Pns6与ssRNA的结合,600mM NaCI才使其50%结合复合物分离; Pns6在60Oc或80Oc中保温5 min后不影响其与ssRNA的结合活性,具有较高的热稳 定性。缺失实验表明,富含碱性氨基酸的肤段(201一273位)是Pns6蛋白唯一的核酸 结合域。Westem bolt发现Pns6主要定位于细胞内膜(P3o部分),可能不是病毒的移 动蛋白。 (3)RRSV 510基因片段编码的非结构蛋白Pnslo具有ATPase的保守序列。为了 检测其ATpase活性,克隆表达了pnslo基因的ORF(142一1032)。纯化的pnslo蛋白具 有ATPase活性,最佳pH为8.0,最佳温度为47℃,酶活力依赖二价阳离子MgCI:或 CaC12,而不依赖一价的NaCI;最佳二价阳离子浓度为lmM。动力学测定表明其Klll 为0.284mM,高浓度底物抑制其反应。Pnslo还能水解其它的NTPs和dNTPs。点突变 实验表明,当其ATPase酶保守模体G20KT变成G20QT,ATP水解能力随即丧失。进一 步的实验表明,Pnslo底物切割位点为ATP酶的Y一尸i。这是在植物呼肠孤病毒中第一 次报道此类病毒具有ATPase活力。 WP=4 摘要 论文的第二部分主要是建立一种能快速区分新城疫疫苗毒与野毒,并能同步测定其 毒力和基因型的新的检测技术。 新城疫病(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一种禽类烈性传染病。NDV在系 统分类学上属于副粘病毒科(P aramyxoviridae),腮腺炎病毒属(Rubulavirus)家族的成 员。其基因组为一条单股负链RNA,共有15 000多个碱基,含有6个基因,编码的6 种蛋白分别为核衣壳蛋白(NP),磷蛋白(P),基质蛋白(M),融合蛋白(F),血细胞凝 集素一神经氨酸酶(HN)和大聚合酶蛋白(L)。F蛋白是融合病毒脂蛋白囊膜与宿主细 胞表面包膜的主要因子,其裂解位点氨基酸组成是病毒毒力的主要决定因素。根据F基 因序列的差异,对NDV的系统发育进行分析,可以把NDV分为I一VH共7个基因型。 对GenBank收录的NDVF基因序列分析发现,其片段22一420的序列可以很好的 用于野毒和疫苗毒的区分。设计特异通用引物,可以用RT一PCR的方法将其扩增出来, 并直接测序。通过对La Sota和I系疫苗同一厂家同一批号、不同批号和不同厂家的产 品,以及各种变异株和混合疫苗大规模的测序,我们获得了疫苗的遗传突变率和操作误 差,同时我们测定了全国各地常用的各种疫苗,建立了标准疫苗序列库。在此基础上, 我们开发出野毒和疫苗毒的自动化分析软件—新城疫毒霸。因为该片段包含F基因的 裂解位点,并可用于基因分型,所以新城疫毒霸还能同步的测定检测样品的毒力和基因 型。同时,软件还充分考虑了裂解位点和非裂解位点的突变对毒力影响的差异以及操作 (测序等)可能出现的各种错误,设置了比较复杂的组合判定条件,尽量减少不必要的 重复劳动并提高判定的准确性。为了方便非专业人士的使用,新城疫毒霸界面比较友好, 各种参数可以很容易的进行修改,结果输出也很直观。而且,软件还能批量处理数据, 极大的提高了工作效率。 该方法的建立可以解决出口检疫方面存在的实际问题,打破技术壁垒,减少不必要 的损失,促进禽类产品的出口创汇。同时对国内NDV的流行、预防也具有重要的指导 价值。研究中,我们还首次发现了国内鸽源基因VII型NDV株的存在,并对其形态特征, 毒力,致病性,部分F基因序列特征进行了研究。


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