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过量表达棉花分泌型漆酶拟南芥对酚酸类物质和三氯苯酚的植物体外修复

王国栋  
【摘要】:我们从亚洲棉 (Gossypium. arboreum L.) 悬浮细胞cDNA文库中分离到一个编码漆酶的克隆,命名为GaLAC1。序列分析表明,GaLAC1编码含566个氨基酸残基的蛋白质(63.34 KDa),含4个铜离子结合域,17个推断的糖基化位点,其N-端23个氨基酸为信号肽。GaLAC1与烟草中分离的一个漆酶氨基酸序列同源性最高,达45%。 Northern 杂交和RT-PCR分析表明,GaLAC1在有腺体棉 (G. hirsutum cv. Zhong-12) 幼苗的根中有高水平的转录,而在无腺体棉 (G. hirsutum. cv. hai-1) 幼苗的根中转录水平明显降低;在陆上器官均未检测到转录本。用黄萎病菌激发子处理无腺体棉幼苗的根,GaLAC1基因的表达被诱导。GaLAC1与棉酚合成相关基因在根部的表达特征很相似。根的免疫定位和组织化学染色结果表明,GaLAC1和棉酚类似物均分布于根尖的外层细胞,推测的GaLAC1可能参与棉酚类似物与细胞壁的交联。对二倍体棉种亚洲棉Southern杂交分析表明,棉花基因组含有数个与GaLAC1相似性很高的成员。 我们构建了两个表达载体,pPIC3K/GaLAC1和 pPIC9K/GaLAC1,其中pPIC3K/GaLAC1载体含有GaLAC1的信号肽而无其他信号肽,pPIC9K/GaLAC1含载体信号肽但去除了GaLAC1的信号肽。将两个载体转入酵母Pichia pastoris GS115中,诱导后GaLAC1均得到表达并分泌到培养基中。体外酶活分析表明,酵母表达的GaLAC1底物广泛,对阿魏酸,芥子酸,丁香酸,香草酸等酚酸类物质都有一定的催化活性。L-半胱氨酸,EDTA,NaF,SDS等铜离子螯合剂都可不同程度地抑制GaLAC1的活性。 WP=3 GaLAC1酶活最适pH为4.0。 为了进一步研究GaLAC1的功能,我们以35S启动子驱动GaLAC1在拟南芥中过量表达,挑选LAC 4-2等五个转基因株系作深入分析。这五个转基因株系在正常条件下没有可见表型变化,其根部漆酶活性比野生型提高了约15倍,分泌的漆酶活性比野生型高出35倍。体内酚类物质含量分析表明,与野生型植物相比,转基因植株可溶性的酚类物质略有下降而细胞壁结合酚类物质有所上升。我们利用HPLC-MS等技术对下列化合物的结构进行了鉴定:1, sinapoyl glucose; 2, Rha-Glc-Rha-kaempferol; 3, Glu-Rha-kaempferol; 4, Rha-Rha-quercetin; 5, sinapoyl malate; 6, Rha-Rha-kaempferol。其中转基因植株中sinapoyl malate含量明显下降。 将生长四天的幼苗 (根长约1厘米) 移至含有各种酚酸类物质的培养基上继续生长,发现高表达GaLAC1转基因拟南芥对芥子酸,丁香酸,香草酸及芥子酸/丁香酸,芥子酸/香草酸等组合表现出比野生型强的抗性。我们还对抗性产生的机理进行了研究,发现转基因拟南芥的根部可大量分泌GaLAC1,GaLAC1在植物体外可以催化酚酸类物质氧化形成毒性较小且较难进入植物体内的寡聚物。我们还发现转基因植株对三氯苯酚的抗性增强,而且分泌的GaLAC1可降解三氯苯酚。 综合分子生物学,生化以及转基因的实验结果,我们认为GaLAC1在植物体内参与了酚酸类物质与植物细胞壁的交联,而且GaLAC1可以体外催化酚酸类物质转化成毒性较小的寡聚物。 三氯苯酚是危害最大的环境污染物之一。本研究为污染土壤的植物体外修复(Phytoremediation ex Planta) 提供了一条新的技术路线。许多酚酸类物质被认为是他感化合物 (allelochemicals),因此植物分泌型漆酶可能在植物间相互作用、生存竞争和进化过程中起重要作用。


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