福寿螺（Ampullaria crossean）多功能纤维素酶EGX的研究

【摘要】：动物自身纤维素酶是近年来纤维素酶研究领域的热点。我们用未经任何化学处理的稻草为底物,筛选到福寿螺(Ampullaria crossean)的高比活力的纤维素酶系。从螺胃液中,经50%饱和度硫酸铵分级、DEAE-Sephadex A-50、Bio-gel P-100凝胶、Phenyl-Sepharose CL-4B等柱层析,得到的SDS-PAGE和等电聚焦电泳一的分子量41.5kDa,等电点约为pI7.35纤维素酶。该酶对对-硝基酚纤维二糖苷(pNPC)、微晶纤维素Sigmacell、羧甲基纤维素(CMC)、Birchwood的可溶性木聚糖(soluble xylan prepared from xylan from birchwood) 以及Oat spelt的木聚糖(xylan from oat spelt)的比活力分别为 12.5,37.2,40.3,196和275 U/mg。即是一种具有外切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶和内切-β-1,4-木聚糖酶等三种酶活性的多功能纤维素酶(简称为EGX)。此外,在EGX单独存在下,它?能把未经任何化学处理的稻草水解为简单糖。 EGX对可溶性木聚糖、对-硝基酚纤维二糖苷(pNPC)、羧甲基纤维素(CMC)的水解活性分别在53℃、55℃、50℃达到最高值,而水解这三种底物的最适pH范围分别为pH4.8-6.0、pH4.8-5.6、pH4.4-4.8。0.2mM和100mM氯化钠存在下,0～100mM范围的纤维二糖对EGX的pNPC水解活性无抑制作用。初步结构分析结果表明EGX是一种糖蛋白,它没有二硫键,但具有2个包埋于分子内部的巯基。 F-、Cl-、Br-、I-、NO3- 等 5 种一价阴离子对EGX的pNPC水解活性即外切-β-1,4-葡聚糖酶活性都是必需的,且表现出明显的激活作用。只有Cl-和Br-为羧甲基纤维素(CMC)水解活性即内切-β-1,4-葡聚糖酶活性活性所必需。而以上5 种一价阴离子对EGX的木聚糖水解活性即内切-β-1,4-木聚糖酶活性没有显著影响。Cl-、Br-、NO3- 三种离子均只影响pNPC水解反应的Km,但并不影响Vmax值。Cl-离子的存在对EGX荧光光谱和圆二色性谱不产生明显影响,但能大大提高EGX的热稳定性。 同时,克隆了EGX的cDNA, 该cDNA长1411bp,包括1185bp开放阅读框、翻译起始密码子ATG上游162bp非翻译区、翻译终止密码子TAG下游41bp WP=3 非编码区Poly(A)尾,并且在翻译终止密码子TAG下游17bp位置含有序列AATAAA,可能为Poly(A)加尾信号序列。开放阅读框(ORF)长度为1185bp,编码395个氨基酸(含起始的Met),并且不含有常见的N-端信号肽。氨基酸序列相似性比较表明EGX属于糖苷水解酶第10家族(GHF10)。氨基酸序列的疏水簇分析(HCA)显示,EGX可能并不含有可分离的催化结构域和底物结合结构域。 EGX cDNA可在大肠杆菌中以包涵体的形式得到高表达。而在甲醇酵母Pichia pastoris中EGX以被过度糖基化的形式(分子量至65.0kDa)分泌表达在培养基中,重组表达的EGX具有外切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶和内切-β-1,4-木聚糖酶三种水解活力。 以福寿螺卵巢组织基因组DNA为模板,扩增得到编码EGX的基因组DNA片段。所得福寿螺EGX基因组片段长4892bp,该片段含有9个外显子和8个内含子,8个内含子分别位于开放阅读框的74bp、122bp、280bp、336bp、473bp、646bp、753bp和972bp处。证明多功能纤维素酶EGX是由福寿螺自身产生。 福寿螺EGX基因的克隆证明了动物纤维素酶体系与微生物纤维素酶体系相似,也含有外切-β-1,4-葡聚糖酶,同时,还证明了在福寿螺中存在内源性木聚糖酶。这也是首次证明了动物也存在自身的木聚糖酶。EGX也是第一个被克隆的动物多功能纤维素酶基因。